高效液相色譜法的應用遠遠廣于氣相色譜法。它廣泛用于合成化學、石油化學、生命科學、臨床化學、藥物研究、環境監測、食品檢驗及法學檢驗等領域。
一. 在食品分析中的應用
1.食品營養成分分析：蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸(鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等)、有機胺、礦物質等;
2.食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑(合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、亮藍等)、抗氧化劑等;
食品污染物分析：霉菌毒素(黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等)、微量元素、多環芳烴等。
二. 在環境分析中的應用
多環芳烴(特別是稠環芳烴)、農藥(如氨基甲酸脂類，反相色譜)殘留等。
三. 在生命科學中的應用
HPLC技術目前已成為生物化學家和醫學家在分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨床化學、分子生物學等必不可少的工具。其在生化領域的應用主要集中于兩個方面：
1. 低分子量物質，如氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測定。
2. 高分子量物質，如多肽、核糖核酸、蛋白質和酶(各種胰島素、激素、細胞色素、干擾素等)的純化、分離和測定。
過去對這些生物大分子的分離主要依賴于等速電泳、經典離子交換色譜等技術，但都有一定的局限性，遠遠不能滿足生物化學研究的需要。因為在生化領域中經常要求從復雜的混合物基質，如培養基、發酵液、體液、組織中對感性趣的物質進行有效而又特異的分離，通常要求檢測限達ng級或pg級，或pmol，fmol，并要求重復性好、快速、自動檢測;制備分離、回收率高且不失活。在這些方面，HPLC具有明顯的優勢。
四. 在醫學檢驗中的應用
體液中代謝物測定;藥代動力學研究;臨床藥物監測：
1. 合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物(冬眠靈、氯丙咪嗪、安定、利眠寧、苯巴比妥等)、黃胺類藥等。
2. 天然藥物生物堿(吲哚堿、顛茄堿、鴉片堿、強心甙)等
五.在無機分析中的應用
陽、陰離子的分析等。
