甘草酸中糖苷鍵的立體構型 綜合探討交流

　　近來要寫關于甘草酸的一篇文章，具體一查文獻才糊涂了：文獻上對3位糖苷鍵的構型說法不一，有的說是 alpha，有的說是beta。還發現一個現象：國外的文獻上都是beta構型，但中文文獻全是alpha，甚至連藥品說明書都這么說。搜索了一下論壇，這是幾位戰友的帖子，異口同聲地認為是alpha。

　　我感到很奇怪，糖苷鍵的構型的指正現在應當是很容易的事了，為什么會有這種分歧? 再者，甘草酸是很常用的藥，這么簡單的東西如果連立體構型都搞不清楚，也太不應該了。

　　leehvidxy，

　　這個問題問的非常好!老早以前我就對甘草酸結構中的C-1'-O糖苷鍵構型有疑惑，就目前了解的情況跟大家交流一下。

　　日本學者的主流觀點都是beta型的[Yakugaku Zasshi，2000，120(10)：849-862]，偶爾看到韓國Kim DH報道中說是alpha糖苷鍵[Biol Pharm Bull， 1997，20(8)：834-837]，其報道的C-1‘ 13C-NMR為106.95，但后來的文章中則有成甘草酸的C-1'-O糖苷鍵構型為beta型[Biol Pharm Bull， 1999，22(3)：320-322]，且其C-1‘ 13C-NMR還是為106.95，該作者以后的文章中均認定為beta構型。可見其[Biol Pharm Bull， 1997，20(8)：834-837]一文有誤。

　　用酶水解甘草酸時，常用的工具酶均為 beta-glucuronidase，該酶對糖苷鍵的識別非常專一[這也是糖苷酶的特性之一]，不同的來源的beta-glucuronidase可以水解甘草酸的一個或兩個糖苷鍵，這也間接證實了糖苷鍵的構型，但不是直接的證據，說服力不強。下面給一篇俄文翻譯的文章，該文用13C-NMR證實了甘草酸中的兩個糖苷鍵都是beta型而非alpha型的。

　　Khalilov, L. M., L. A. Baltina, L. V. Spirikhin, E. V. Vasil'eva, R. M. Kondratenko, A. A. Panasenko and G. A. Tolstikov. "Carbon-13 Nmr Spectra of Biologically Active Compounds. Viii. Stereochemistry of a Triterpene Glycoside, Glycyrrhizic Acid, and Its Derivatives." Khimiya Prirodnykh Soedinenii, no. 4 (1989): 500-05.

　　本文給出了甘草酸及其4個衍生物的詳細13C-NMR數據，以此為依據，重新修正了糖鏈上異頭中心的構型，并推定C-1‘的構型為beta型。文獻中沒有應用13C-NMR確定甘草酸的報道。此前我們報道了甘草次酸衍生物的的13-NMR數據。本文給出了甘草酸及其4個酯類衍生物的詳細13C- NMR數據，并以此推定糖鏈的立體構型。

　　Lythgeo和Trippett采用水解和水解產物酯化物的旋光數據確定了甘草酸糖鏈的立體化學結構。他們認為糖鏈中兩個葡萄糖醛酸之間的糖苷鍵為beta構型，糖鏈與苷元之間的糖苷鍵為alpha構型。因此按照以前的研究成果，甘草酸的結構為3beta-[O-alpha-D- glucopyranuronosyl-(1 → 2)-beta-D-glucopyranuronosyloxy]-11-oxo-(18betaH)-olean-12-en-30beta-oic acid。

　　我們詳細考察了甘草酸和它的衍生物的13C-NMR數據，表1給出了它們的化學位移。衍生物的大多數信號與甘草酸的NMR信號一致。甘草酸及其衍生物的13C-NMR信號按照其苷元及其衍生物的13C-NMR信號和文獻中相應糖苷的13C-NMR信號指認。甘草酸中三萜苷元部分很容易按照甘草次酸的 13C-NMR數據鑒定出來，唯一的例外是與糖基相連C-3位醇碳原子，它在90.74ppm處發生共振。這種情況下，糖基化作用達到 12ppm，表明O-C-3鍵為beta構型，這與甘草酸分子中苷元的立體化學結構一致。

　　糖基中的兩個羧基基團的信號出現在弱場區(172.29ppm)。弱場區的106.01和105.10 ppm分別對應于葡萄糖醛酸的C-1'和C-1"碳原子。連接末端葡萄糖醛酸殘基的C-2'醇碳原子的信號與其他糖基碳原子相比(72.85-77.35 ppm)，在低場出現(83.78ppm)。

　　按照文獻的結論，根據D-葡萄糖醛酸衍生物化學位移的增量可以推斷C-1'異頭中心碳原子的構型。通過比較計算值和實驗數據，可以明確地確定C-1'異頭中心碳原子的構型為beta型。如果按照alpha構型計算，以4C1構象為立體化學模型，存在 1，3-立體二軸作用的貢獻，C-3‘和C-5’信號應該在強場出現(計算值分別是72.5ppm和71.9ppm)。若以1C4構象為立體模型，所有的醇碳信號的應該出現抗磁性位移。

　　在研究cyclosieversioside H的13C-NMR的糖鏈結構時，也得到了類似的數據。甘草酸五乙酰三甲酯的信號更為突出，其C-1‘和C-1“信號分別是103.43和 100.88ppm，表明糖苷鍵為beta構型。與五乙酰纖維二糖的13C-NMR對比，也證實了甘草酸五乙酰三甲酯中不存在alpha型異頭碳原子。表一給出計算值也說明C-1’異頭中心為beta型。甘草酸三甲酯的醇碳碳原子的化學位移與甘草酸十分接近。甲氧羰基的羰基碳原子信號在弱場出現(169.00ppm)，甲基信號比較接近(C-7‘：52.99和C-7“：53.18ppm)。

　　由于氧甲基化作用，全甲基化的甘草酸的醇碳碳原子都在弱場出現，比甘草酸相應的碳原子低10ppm。甘草酸三甲酯的五苯甲酸酯在128-134ppm區出現芳香碳信號。

　　根據上述甘草酸及其衍生物的13C-NMR數據，甘草酸的結構應該是3beta-[O-beta-D- glucopyranuronosyl-(1-2)-beta-D-glucopyranuronosyloxy]-11-oxo-(18beta H)-olean-12-en-30beta-oic acid。

　　上述13C-NMR數據通過化合物V的H-NMR進一步印證。H-NMR也證實了甘草酸中的糖苷鍵為beta構型。

　　目前的很多資料中對甘草酸的糖苷鍵的構型還存在模糊的認識，包括一些知名的試劑公司產品目錄、檢索工具甚至一些國家的藥典。這個1955年結構就已經確定的化合物，到了今天應該有個正名。

　　還有一個例子就是甘利欣，它就是甘草酸18位H異構體，但現在都被叫成了甘草酸二銨，而在檢索工具上它也就成了甘草酸的二銨鹽，所以導致老外根本就不明白甘草酸的二銨鹽為什么會比單銨鹽的療效好。而且在甘利欣的說明書上給的結構式就是3-alpha糖苷鍵型的，而且也沒有說明18位的H原子異構。

　　vitaminb1

　　我也發現國外的文獻幾乎一致認為是beta，不知為何國內都認為是alpha。難道是都引用同一篇參考文獻，以訛傳訛?

　　還有兩個小問題，想請教一下(我是新手，了解不多)，1、根據文獻上的兩種方法——酶水解法和13C NMR法，是否可以真的完全確證糖苷鍵的構型是beta而不是alpha?我對酶水解法了解不深，不過從13C NMR的化學位移判斷構型不是那么準確的。2、不知甘草酸是否存在alpha構型的異構體，這樣的話，對照一下二者的光譜數據就行了。

　　leehvidxy，

　　文獻[Lythgoe, B. and S. Trippett. "The Constitution of the Disaccharide of Glycyrrhinic Acid." Journal of the Chemical Society (Resumed) (1950): 1983-90.]證實alpha構型，采用的對比類似物的旋光度差異，也非直接證據。可能是這篇文章成為alpha構型定論的依據[被引用69次]。

　　姚新生主編的天然藥物化學第三版p268-269中，甘草酸為3-alpha構型，beta構型的叫烏拉爾甘草皂苷A[張如意，藥學學報，1986，21：510]。而兩者的熔點和旋光值都存在較大的差異。不可忽視的一個問題是，甘草酸的來源可能來自烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)，不同的來源可能是造成出現不一致的原因。

　　關于糖苷酶的選擇性可以參見"糖類的生物化學" [作者: 吳東儒等編著 出版日期: 1987]，具體哪一頁我忘記了，手頭沒有書。對于糖苷鍵的構型確定，采用糖苷酶是一種常用的方法，一般是基于糖苷酶對糖的異頭體C高度專一的特性。我認為例外是有可能的，所以也覺得這種方法有一定的缺陷。不過如果發現一種酶能同時水解alpha和beta糖苷鍵的話，估計也是一個很了不起的發現。

　　還沒有找到甘草酸的x-ray文獻，一般認為甘草酸結晶會含1-5個結晶水，而且純的甘草酸并不穩定，一般都是以鹽的形式制備。從目前的文獻報道看，甘草酸和烏拉爾甘草皂苷A是3-糖苷鍵的異構體，而市售甘草酸來自什么甘草就不清楚了，這兩個東西還真是不好鑒別，除非用酶水解看水解反應的情況了。

　　vitaminb1

　　我看了leehvidxy提供的幾篇文獻，[張如意，藥學學報，1986，21：510]確證烏拉爾甘草皂苷A為beta構型的證據應當是充分的，兩個異頭碳的1H偶合常數分別為7.71和7.61，后面給的碳譜數據也可以說明問題。文章同時還分離鑒定了已知化合物甘草酸，遺憾的是僅從數據上分析是甘草酸，沒有與文獻值對照(比如：其理化常數與分析數據與文獻一致)，也沒有與甘草酸成品進行共薄層TLC或混合熔點測定。這篇文章的通訊作者是 celan老師。誠如leehvidxy 所說，“甘草酸的來源可能來自烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)，不同的來源可能是造成出現不一致的原因。” 文獻上對構型報道不一致，可能他們的鑒定都沒有錯，只是他們把兩種異構體都當成甘草酸了。不知這樣猜測對不對。如果這樣的話，我們就不知道作者從烏拉爾甘草中發現的甘草酸到底與那種甘草酸結構一致了。

　　從文獻[Yakugaku Zasshi，2000，120(10)：849-862]中發現一個問題，就是本文作者所用的糖苷鍵為beta的甘草酸的碳譜數據幾乎與張如意發現的烏拉爾甘草皂苷A完全一致。那么，是否可以認為，張如意發現的烏拉爾甘草皂苷A，就是現在所說的甘草酸;而張如意發現的“甘草酸”，卻是現在所說的甘草酸的差向異構體。

　　以下是兩篇文獻的碳譜數據, 請大家看看他們可能不可能是同一種物質。(碳譜差別不大,但異頭碳所連氫的化學位移差別較大,可惜沒有給出更詳細的氫譜數據.)

　　烏拉爾甘草皂苷A[張如意，藥學學報，1986，21：510] 溶劑：DMSO

　　C-2 26.9, C-3 88.3, C-4 38.5, C-11 198.8, C-12 128.1, C-13 169.2, C-30 170.0,

　　C-1' 103.2, 2' 83.1, 3' 74.9, 4' 71.3, 5' 75.2, 6' 168.8,

　　1'' 105.0, 2'' 74.9, 3'' 75.8, 4'' 71.3, 5'' 75.8, 6'' 168.8.

　　1H-NMR: 1' 4.45(J=7.71), 1'' 4.53 (J=7.61)

　　甘草酸[Yakugaku Zasshi，2000，120(10)：849-862] 溶劑: 不詳

　　C-3 88.1, C-11 198.8, C-12 127.2, C-13 169.5, C-18 47.9, C-30 177.5

　　1' 103.3, 2' 82.5, 3' 75.0, 4' 71.1, 5' 75.7, 6' 170.0

　　1'' 104.6, 2'' 74.5, 3'' 75.5, 4'' 71.4, 5'' 76.1, 6'' 169.8

　　1H-NMR: 1' 4.31(J=6.9), 1'' 4.47(J=7.3).

　　vitaminb1

　　我對比旋光度法測定絕對構型知道得不多，但總感覺 Journal of the Chemical Society (Resumed) (1950): 1983-90.中判定為alpha構型很粗糙。此外，leehvidxy戰友列出的俄國文獻的碳譜數據中，C1'到C6''的數值下面都有一個括號給出另外一個值。我弄不清楚括號里的數值是什么意思，不過不難看出，這篇文獻中甘草酸(alpha糖苷鍵)C1'~C6'的化學位移值(括號中的數值)與張如意報道的烏拉爾甘草皂苷A(beta糖苷鍵)基本上是一致的。

　　那么就有一個問題，到底自然界中的甘草酸的糖苷鍵有兩種異構體呢，還是只有這么一種?我看過的文獻很少，請問leehvidxy戰友和celan老師認為如何?

　　leehvidxy，

　　蘇聯文獻首先指出以往甘草酸的結構是alpha型，該文作者經過實驗測定和結果分析，修正了這個錯誤。他們認為是beta型的。

　　日本藥學雜志文章【Shibata, S. "A Drug Over the Millennia: Pharmacognosy, Chemistry, and Pharmacology of Licorice." Yakugaku Zasshi 120, no. 10 (2000): 849-62.】【注：作者Shibata, S是國際知名的天然產物研究專家，其實驗室是以其命名的，國際上享有盛譽】論述甘草酸結構時，也指出，旋光法測定的糖苷鍵構型被后來的碳氫NMR結果修正，所引用的文獻就是前面那篇蘇聯人的文獻和Shibata本人的實驗結果【Shibata, Shoji, Antitumor-promoting and Anti-inflammatory Activities of Licorice Principles and their Modified Compounds. ACS Symp. Ser. 1994, 547 (Food Phytochemicals for Cancer Prevention II): 308-321.】。

　　至于國內為什么都是認為是alpha型的，我查閱了一些書籍，林啟壽老先生給出結構式，為alpha糖苷鍵，但是沒有給出參考文獻【林啟壽, 中草藥成分化學. 科學出版社: 北京, 1977; p440-441】，韓公羽也給出相同的結構式，并且給出了參考文獻【韓公羽; 沈企華, 植物藥有效成分的研究與開發. 杭州大學出版社: 杭州, 1991; p48-49】，該參考文獻是“青海高原生物研究所，解放軍第四醫院。中草藥通訊，1975，(6)：19”，但不知道里面是否講述甘草酸的結構，如果韓公羽治學嚴謹的話，這篇參考文獻可能就是國內最早闡述或介紹甘草酸結構的公開文獻了。而其他各種《中藥化學》書包括肖崇厚先生著作，《天然藥物化學>書包括姚新生先生和王憲楷先生之作者等都給出的是alpha構型，他們著作多在前述論文發表前成書【1989年以前】，而再版時沒有修正。國內其他諸多書籍中也沒有甘草酸為beta糖苷鍵的論述。

　　綜合以上文獻，甘草酸的正確結構應該是3beta-[O-beta-D-glucopyranuronosyl-(1-2)-beta-D- glucopyranuronosyloxy]-11-oxo-(18beta H)-olean-12-en-30beta-oic acid。前述的氫氫自旋耦合常數也證實C-H'為軸向而非平伏。

　　而至于張如意文中的疑問，是否是因為植物來源的不同或者甘草酸的成了不同的鹽所致呢?

　　又查到一篇2005年剛出的新文獻，還是Khalilov, L. M., L. A. Baltina研究小組的論文， 這回就把問題搞清楚了，他們采用的是高分辨 碳NMR【150 MHz】，氫NMR【600 MHz】。2D-HH同核【HSQY-TOCSY】，C-H異核譜【HSQC, HMBC】實驗，完全指定了糖鏈上的H，確定出甘草酸的兩個糖的構型都是beta型的。順便提一句，CA上甘草酸和18alpha-甘草酸的結構都是采用的alpha糖苷鍵與苷元連接的表示。

　　附文獻：Baltina, L. A., O. Kunert, A. A. Fatykhov, R. M. Kondratenko, L. V. Spirikhin, L. A. Baltina, Jr., F. Z. Galin, G. A. Tolstikov and E. Haslinger. "High-Resolution 1h and 13c Nmr of Glycyrrhizic Acid and Its Esters." Chemistry of Natural Compounds 41, no. 4 (2005): 432-35.

　　gemmy，

　　...........However, signals for all protons in the PMR of GA have not yet been assigned owing to the use of instruments with lowworking frequencies (up to 300 MHz)....

　　........the first time to assign completely proton siglans at strong field of 0.7-2.3 ppm and to refine assignments made previously for C atoms in the 13C NMR spectra.........

　　文章的作者并沒有否認以前的構型測定，說明前人的工作是正確的(至少沒有原則上的錯誤)其貢獻主要如上(即高場氫的全歸屬)。

　　vitaminb1

　　原來學術界已經確認為beta構型，而國內的參考文獻還一直沒有更新過。去年有一位師姐答辯，做的課題就是甘草酸的質量分析標準，從頭到尾都說是 alpha構型，根本沒有提及有文獻報導beta的事。當時有位同學提問說1位質子耦合常數太大，可能是beta的，那位博士生說“文獻的數據就是這樣，我測得結果也是這樣，不用管他。” 老師則沒有一個表示質疑的。聽我在藥物分析的同學說，做藥分基本上不看國外的文獻，因為國外沒有藥分這個專業。(不知是真是假，道聽途說而已。)

　　celan

　　當時有位同學提問說1位質子耦合常數太大，可能是beta的，那位博士生說“文獻的數據就是這樣，我測得結果也是這樣，不用管他。” 老師則沒有一個表示質疑的。值得深思啊!學生馬虎一點可以理解，老師這樣的表現就太那個了....,不過，這年頭，這樣的導師還是很多的。

　　" 做藥分基本上不看國外的文獻"，也可以理解,因為常規分析必須按藥典進行，有標準/對照品可循...藥分所含蓋的內容比較多，有些還是要看國外文獻的。中國藥典中有些品種的分析控制方法確實值得商榷，但一旦成為法典，就得執行，要修改，只能等下一版了。所以常規藥分是比較"死板"的。