蛋白質的二硫鍵定位

原理：經過對Cys的完全還原修飾（DTT/IAA）或不完全還原修飾（TCEP）與不修飾的對比，酶解后用串聯質譜法（MS2）對含有二硫鍵的肽段的b離子/y離子分析，確定蛋白質中二硫鍵的位置。

儀器：Finnigan LCQ Deca XP / Finnigan LTQ

樣品要求：

含鹽量：揮發性無機鹽<20mM；不揮發性無機鹽<5mM；樣品蛋白質總量>10nmol；樣品純度>90%；樣品應盡量保持其純度不要添加任何保護劑或其他物質。

實例分析：
某樣品二硫鍵定位分析
理論的二硫鍵配對情況：Cys6-Cys34和Cys104-Cys144

 

 

Fig1：肽段GSGGGCDLPQTHSLGNR的MS/MS圖譜。樣品經過酶解還原后鑒定。

Fig2：肽段ISPFSCLK的MS/MS圖譜。樣品經過酶解還原后鑒定。

Fig3：肽段FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR的MS/MS圖譜。樣品經過酶解還原后鑒定。

Fig4：肽段YSPCAWEVVR的MS/MS圖譜。樣品經過酶解還原后鑒定。

Fig5：對應于FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR和YSPCAWEVVR形成二硫鍵后的肽段的full scan圖譜。樣品經過酶解還原后鑒定。

實驗結果及分析：

1）  非還原的Trypsin酶解質譜分析中，沒有發現帶Cys的肽段；

這些肽段（GSGGGCDLPQTHSLGNR；ISPFSCLK；YSPCAWEVVR；FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR）在對應的還原的Trypsin酶解質譜分析中都被發現，那么可以推測待檢測樣品沒有自由的Cys，可能形成了兩對二硫鍵。

2）  非還原的Trypsin酶解質譜分析中。質荷比M/Z1817.8(+3)/1363.7(+4)/1091.6(+5) (對應于YSPCAWEVVR和FYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVR形成二硫鍵后的肽段)被發現；而在還原的Trypsin酶解質譜中這些沒能發現。那么通過Fig3，4，5可以確定二硫鍵Cys104-Cys144；考慮到樣品形成了兩對二硫鍵，那么通過Fig1，2可以推測二硫鍵Cys6-Cys34