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重磅！2023年度MST技術用戶案例精選

NanoTemper

2024.1.26

不知不覺已步入2024年，NanoTemper很榮幸又陪伴用戶度過了充實又有意義的一年。2023年NanoTemper的用戶使用MST技術發表的文章超過2000篇，其中也有不少文章發表在Cell、Nature、Science三大主刊，非常感謝用戶對我們的信任。

MST微量熱泳動技術能夠彌補傳統的互作技術在高樣品消耗、小分子檢測以及操作繁瑣等方面的不足，能夠輕松高效地檢測各類具有挑戰的樣品，因而快速地被應用在各種領域。

下面是我們的技術專家們精心挑選的9篇高分文獻，為大家解讀MST技術是如何在四個不同應用方向助力科學研究的。

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	小分子在進行小分子親和力檢測時，您可能會遇到樣品分子量低或與目標蛋白分子量差異大導致檢測信噪比低，實驗難優化的問題。MST技術檢測不依賴于分子量變化，結合引起的電荷或構象改變同樣會被靈敏感應到。中國醫學科學院 \| 小分子抑制 α-synuclein 聚集帕金森病(PD)的病理表現是α-synuclein的聚集，α-synuclein 被認為是治療帕金森病的一個潛在靶點。中藥天麻中聯苯芐型化合物20C，可顯著增強PD模型的細胞活力，可能是天麻治療PD的重要生物活性成分。然而，其作用靶點和作用機制尚不清楚。今年中國醫學科學院藥物研究所發表在Cell Death and Disease的研究結果發現，小分子20C可抑制α-synuclein 聚集并阻止PD的進展，并且明確了這些改善是來自20C和α-Syn fibrils的直接互作。 α-Syn fiber是由α-Syn單體組裝而成的大聚集體，分子量超過420kD，而20C為小分子，二者之間分子量倍數差別在幾百倍以上，很難通過基于分子量變化方法進行互作親和力檢測。作者使用MST技術檢測了 α-Syn fibrils 與20C的互作（K_d為37μM），證明二者之間存在直接互作。圖1. 使用MST測定20C與α-Syn fibrils直接相互作用 https://doi.org/10.1038/s41419-023-06116-0 第二軍醫大學 \| 黃芪甲苷衍生物治療梗死后心衰的作用和機制來自第二軍醫大學以及中國醫學科學院藥用植物研究所的張衛東團隊在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上撰文，報道了黃芪甲苷優化衍生物HHQ16通過直接作用于心肌細胞逆轉肥厚，有效地逆轉了心肌梗死誘導的心肌重構，并改善了心功能。研究者對一個新發現的人類 lncRNA(Lnc4012) 及其小鼠同源基因(Lnc9456)進行了全面的鑒定，并對lnc4012/lnc9456在心肌梗死誘導的心肌肥大和心力衰竭的發生發展中的作用提供了新的機制見解，并證明lnc4012/lnc9456是一種新的真正的靶點。在研究過程中，研究者通過病理及藥理實驗確定了lnc9456為HHQ16逆轉肥厚和心衰的特異性靶點，并通過MST實驗驗證了HHQ16與lnc9456具有高親和力結合，但與抗肥大lncRNA Mhrt無親和力（圖2）。這表明了HHQ16與lnc9456特異性結合，導致其降解的藥效機制。圖2. MST檢測HHQ16與lnc9456（左）及陰性對照（右）親和力小鼠lnc9456和人lnc4012分子機制具有一致性。HHQ16與lnc4012的親和力高于其小鼠同源基因lnc9456（圖3），并以時間依賴的方式促進體外轉錄的lnc4012降解。研究者利用MST技術驗證了新的小分子HHQ16會與lnc4012/lnc9456特異性結合。而HHQ16與lnc4012/lnc9456的結合會導致其降解，從而拮抗其對心肌細胞G3BP2/NF-κB信號的作用，從而有效地逆轉心肌梗死引起的肥厚和心力衰竭。圖3. MST檢測HHQ16與lnc4012（左）親和力 https://doi.org/10.1038/s41392-023-01660-9 福建農林大學 \| 細胞膜共受體復合體傳遞生長素信號的分子機制 2023年11月，福建農林大學徐通達團隊和楊貞標團隊在Cell期刊在線發表題為 “*ABLs and TMKs are co-receptors for extracellular auxin” 的研究論文，報道了兩個新的質外體定位的生長素結合蛋白， ABL1（ABP1-like protein 1）和ABL2，其與生長素結合蛋白ABP1具有相似結構，在細胞膜上形成ABP1/ABLs-TMK生長素共受體感受并傳遞胞外生長素信號，調控植物生長和發育的分子機制。研究者首先構建了擬南芥ABP1生長素結合位點突變形式的ABP1-5轉基因植株，表型分析發現其與tmk突變體類似，呈現明顯的生長發育和生長素快速響應缺陷，暗示ABP1-5蛋白可能通過對其他質外體定位的，生長素結合蛋白產生顯性負效應，參與TMK介導的生長素信號通路。由于ABP1沒有同源基因，為了尋找其他的生長素結合蛋白，研究者通過檢索TMK1互作蛋白質組學數據庫，鑒定到兩個新的生長素結合蛋白，其與ABP1氨基酸序列相似性偏低，但結構類似，且具有高度保守的生長素結合區域，將其命名為ABL1（ABP1-like protein 1）和ABL2。通過生化分析，發現ABL1蛋白定位于質外體，與ABP1類似，研究者提出了科學假設--細胞膜ABLs-TMK蛋白復合體感知并傳遞胞外生長素信號。表型分析發現：ABL1/2與ABP1的功能具有冗余性，但又有別于ABP1，差異性調控植物的生長發育；ABL1/2與ABP1都通過協同TMK家族，介導生長素的快速響應。作者進一步通過微量熱泳動技術（MST）分析發現：與ABP1類似，ABL1和TMK1胞外域都能特異性的結合IAA（圖4）和NAA等活性形式的生長素分子。*有趣的是，當TMK1胞外域存在的情況下，ABP1和ABL1對生長素的結合能力顯著增強（圖4，ABP1:4.71uM、ABP1/TMK1-ex：0.094uM; ABL1: 1.73uM、ABL1/TMK1-ex: 0.525uM），這表明了ABP1/ABLs和TMK在結合生長素方面存在協同作用。圖4. MST檢測IAA與ABP1, ABL1, TMK1-ex, ABP1-5, and ABL1-M2結合 https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.017

	多肽由于多肽較強的極性偏好，使用其他固定性技術進行多肽親和力檢測過程中，常常遇到黏附的問題，并且很難優化解決。MST檢測無需固定樣品，直接在溶液中進行親和力檢測，可以避免多肽吸附至固相上的問題。北京大學 \| 植物通過有性生殖實現遠緣雜交的新機制 2023年10月7日，北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯合中心、新基石科學實驗室瞿禮嘉/鐘聲團隊在Cell上發表了題為“Antagonistic RALF peptides control an intergeneric hybridization barrier on Brassicaceae stigmas”的論文，提出的柱頭-花粉間識別的“鎖-鑰模型”，闡明了柱頭處的種間/屬間生殖障礙形成的機理，解釋了“花粉蒙導效應”。作者研究發現柱頭的乳突細胞表面的受體FER/ANJ/HERK1/CVY1與乳突細胞自分泌小肽sRALF33等組分協作構建成"鎖"，阻止花粉管穿入柱頭。自己的花粉以及近緣植物種的花粉攜帶的7個旁分泌小肽pRALF11/26等即為"鑰匙"，該“鑰匙”打開柱頭處的"鎖"，使得花粉管可以穿入柱頭。在研究過程中，作者使用MST技術驗證并定量了受體FER/ANJ/HERK1/CVY1與自身分泌的小肽sRALF33以及花粉分泌的小肽pRALF11/26的互作。這也是瞿禮嘉/鐘聲團隊繼2017年Science和2022年Science后第三次用MST檢測蛋白和多肽的親和力。在該互作研究中，涉及到3種小肽，共12組的Kd檢測，MST檢測一對K_d僅需要 200nM 100uL 的蛋白樣品，即使進行多組實驗，也僅需要非常少量的蛋白樣品。MST結果顯示，選定的sRALF33、pRALF11或pRALF26分別可以與FER、CVY1、ANJ和HERK1相互作用，并具有高親和力。圖5. sR33、pR11和pR26與FER (E)、CVY1 (F)、ANJ (G)和HERK1 (H)的外結構域具有較高的結合親和性，而與elf24(陰性對照)的結合親和性不高 https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.09.003 浙江大學\|蛋白質脂化修飾研究 2023年8月，浙江大學生研院林世賢課題組在 Nature Chemical Biology雜志發表了題為“Computational design and genetic incorporation of lipidation mimics in living cells”的研究成果，報告了一種設計脂化模擬的計算方法。研究團隊建立了一個工程系統，用于將這些脂化模擬物整合到大腸桿菌和哺乳動物細胞中幾乎任何所需的蛋白質位置。這項研究策略能夠實現數百種蛋白質脂化的功能獲得研究，促進了卓越治療候選藥物的創造。在該研究中，為了證明基因編碼脂質模擬物在設計和合成治療候選藥物中的效用，研究人員使用MST技術檢測了人血清白蛋白HSA和脂質模擬改造的多肽藥物GLP-1變體之間的相互作用。GLP-1-K20-4HexyF和GLP-1-K20-4OctyF對HSA的Kd值分別為 2.31 μM和0.58 μM，分別比GLP-1-K20-HepoK的15 μM增加了6.5倍和25.9倍。相比之下，野生型(WT) GLP-1未檢測到結合，表明增強的結合是由脂質模擬介導的。圖6. MST分析多肽藥物GLP-1變體對人血清白蛋白HSA的親和力 https://doi.org/10.1038/s41589-023-01400-8

	免純化檢測親和力檢測一般需要高質量和純度的蛋白，而一些蛋白本身很難純化。MST技術可以直接在裂解液中進行親和力測定，特別適合難純化，或純化后不穩定的蛋白樣品，為科研人員節省樣品和時間。武漢大學中南醫院 \| 膀胱癌發生發展機制武漢大學中南醫院、武漢大學醫學研究院王行環團隊此前的研究顯示POLD1是膀胱癌惡性轉變過程中的一個關鍵分子。在此基礎上，王行環團隊證實POLD1在膀胱癌組織中較癌旁組織高表達，在肌層浸潤性膀胱癌中較非肌層浸潤性膀胱癌高表達，且與預后相關。團隊在體內和體外實驗中證明了POLD1能夠促進膀胱癌的增殖和轉移，并在進一步機制研究中發現，POLD1通過與FBXW7競爭性結合MYC，從而減弱FBXW7介導的MYC泛素化降解。此外，機制研究還發現POLD1可以與MYC形成復合物參與MYC的轉錄調控，增強MYC的轉錄活性；另一方面，MYC能夠轉錄激活POLD1，從而形成了一個POLD1-MYC正反饋回路，增強了對膀胱癌的促癌作用（圖7）。這項研究成果于2023年發表在 Nature Communications 雜志。圖7. POLD1通過穩定MYC調節BLCA的增殖和轉移，促進膀胱癌發生發展研究人員首先通過CO-IP驗證了POLD1與MYC的結合，而當去掉MYC中與FBXW7α結合的區域MB1后，就檢測不到結合了。因此研究團隊合成了MB1肽段，然后使用MST技術檢測了POLD1與MB1肽之間的親和力，并與 FBXW7α作對比，證明POLD1對MB1的親和力比FBXW7α強，因此它可以與FBXW7α競爭結合MYC（圖8）。在這個實驗中，POLD1和FBXW7α 也都是與GFP融合表達在293T細胞，直接使用細胞裂解液作為target進行檢測，無需純化蛋白。圖8. MST技術檢測293T細胞中過表達GFP-POLD1的裂解物與MYC-MB1 (WT)肽的結合親和力 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38160-x

	核酸您可以使用帶有CY5標記的核酸直接在溶液中進行親和力檢測，實驗操作簡便且檢測一對樣品僅需10min，無需擔心RNA在檢測過程中降解。 Scripps研究所 \| 靶向RNA降解劑 2023年5月24日，Scripps研究所的Matthew D. Disney教授及其合作者在Nature雜志發表了題為“Programming inactive RNA-binding small molecules into bioactive degraders”的研究論文，利用核糖核酸酶靶向嵌合體技術將非活性小分子重編程為靶向RNA降解劑，成功降解miR-155和癌癥靶標MYC、JUN的RNA。研究人員基于二維組合篩選進行RNA和小分子高通量分子間相互作用檢測，發現了一些可以與pre-miRNA-155結合的小分子。研究人員接下來使用Monolith分子互作儀完成了大量RNA小分子結合表征，驗證了C1僅結合于5′GAU/3′C_A motif，其他RNA凸起或者點突變RNA在相同檢測濃度范圍內看不到明顯的結合信號。圖9. pre-miR-155-binder C1結合曲線小分子結合于pre-miRNA-155的非活性位點，并不會對細胞內的miRNA-155表達水平產生影響。接下來研究人員構建了雙功能小分子核糖核酸酶靶向嵌合體，一端與目標RNA結合，另一端招募并激活RNA酶，從而靶向降解目標RNA。改造后的嵌合體成功在細胞內降低miRNA-155的表達水平，并且在細胞和小鼠模型中抑制了三陰乳腺癌。圖10. 將結合pre-miR-155的惰性結合物轉化為活性RIBOTAC降解劑為了測試該方法的適用性，研究人員又構建了靶向MYC和JUN的核糖核酸酶靶向嵌合體。這兩種蛋白都是重要的癌癥靶點，但都是無序蛋白，被認為是不可成藥的。改造后的核糖核酸酶靶向嵌合體獲得了生物活性并在細胞內精準地靶向降解各自的靶向RNA，使這些癌蛋白驅動的轉錄和蛋白組學進程失效。這項研究表明對于由這些常見但具有挑戰性的致癌基因驅動的癌癥，重編程非活性小分子為靶向RNA降解劑可能會帶來新的變革。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06091-8 北京大學 \| 新型RNA編輯系統開發 2023年北京大學藥學院湯新景教授開發出一種新穎且便捷的光觸發位點特異性RNA編輯系統，并將研究成果發表在Cell Chemical Biology上。為了開發內源性ADAR蛋白的A-to-I可控的編輯策略，作者設計了一種末端有膽固醇修飾的反義寡核苷酸（3’-籠式arASO）：由一段2’-OMe修飾的可編程反義域、用于與靶mRNA雜交的硫代磷酸修飾的3’端和位于5’端的用于招募ADAR蛋白的工程化GluR2 R/G基序組成，這種設計能通過招募內源性的ADAR蛋白來實現位點特異性的RNA A-to-I編輯。并且，作者通過2D細胞和3D腫瘤球的實驗驗證了3’-籠式arASO在的光觸發A-to-I編輯能力。為了研究3’-籠式arASO抑制位點特異性的機制，作者使用MST技術檢測了3’-籠式arASO與蛋白和核酸的互作：ADAR1-p150是主要的RNA單堿基編輯器。MST技術確定了3’-籠式arASO與ADAR1-p150的結合親和力與arASO與ADAR1-p150蛋白的親和力接近，表明膽固醇修飾并不會對其在5’端的ADAR-招募結構域造成明顯影響。圖11. MST技術檢測ADAR1-p150與3’-籠式arASO/arASO親和力 MST技術檢測3’-籠式arASO與不配對的腺苷的單鏈靶RNA（ssRNA）的結合親和力檢測結果表明：3’-籠式arASO在沒有光刺激的情況下與ssRNA（A·C錯配）的結合親和力比其陽性對照的結合親和力低17.4倍，但在給予光照后，其親和力恢復到與陽性對照組相當的水平（左圖）。這表明，在3’-籠式arASO的反義結合域3’端的膽固醇修飾阻斷了其與ssRNA（A·C錯配）的結合。而膽固醇修飾對arASO與完全配對的ssRNA的結合親和力沒有影響（右圖）。圖12. 膽固醇修飾阻斷了3’-籠式arASO與靶RNA的結合從而抑制其位點特異性編輯 https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2023.05.006 中國農業大學 \| 核受體轉錄調節的底物選擇和活性抑制新機制睪丸核受體4 (TR4)調節基因的轉錄激活，在許多疾病中發揮重要作用。TR4對靶基因的調控涉及通過DNA結合域(DBD)與DNA分子的直接相互作用。然而，TR4與靶基因之間特異性的相互選擇性機制不清楚。2023年中國農業大學陳忠周教授課題組在Nucleic Acids Research在線發表了題為 *Structures of human TR4LBD-JAZF1 and TR4DBD-DNA complexes reveal the molecular basis of transcriptional regulation* 的研究論文，解析了TR4-DBD - DNA復合物的高分辨率晶體結構，并通過MST技術進行了大量的親和力檢測實驗，詳細闡述了TR4與dsDNA相互作用以及選擇性。通過對TR4-DBD - DNA復合物晶體結構分析，第129、138等殘基起到結合的關鍵作用，作者生成了不同的TR4DBD的位點突變體，通過MST實驗確定突變后TR4與DNA的親和力大小（圖13）。Y129A、K138A、K142A、R143A和R146A突變對結合的破壞最為明顯，其他突變也在不同程度上削弱了二者的互作。圖13. MST檢測TR4不同突變體與DNA親和力為了驗證TR4的轉錄調控功能，作者分析了一些下游靶基因的潛在啟動子序列，并通過MST實驗確定了TR4在每個靶序列上的K_d值。TR4結合了這些靶基因的每個啟動子，并且結合親和力隨序列的不同而不同（圖14），表明結合親和力的差異可能與dsDNA結合位點的序列特征有關。圖14. MST檢測TR4與不同靶序列親和力晶體結構分析表明，DNA含有兩個重復的AGGTCA基序，與兩個DBD分子形成異三聚體復合體。為了確定AGGTCA中的最佳基序，作者構建具有相同位點突變的dsDNAs，并進行了MST實驗。親和力結果表明，A1G2G3T4C5A6位點替換G2和T4對結合影響最明顯，結合親和力降低了百倍（圖15），說明G2G3T4C5對TR4結合的靶基因至關重要，推斷序列PuGGTCA是TR4的最佳目標基序。圖15. MST檢測不同突變dsDNA和TR4親和力 https://doi.org/10.1093/nar/gkac1259

	參考文獻 1. Peng, Y. et al. A small molecule 20C from Gastrodia elata inhibits α-synuclein aggregation and prevents progression of Parkinson’s disease. Cell Death and Disease 14, (2023). 2. Wan, J. et al. Astragaloside IV derivative HHQ16 ameliorates infarction-induced hypertrophy and heart failure through degradation of lncRNA4012/9456. Signal Transduction and Targeted Therapy 8, (2023). 3. Yu, Y. et al. ABLs and TMKs are co-receptors for extracellular auxin. Cell (2023) doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.017. 4. Lan, Z. et al. Antagonistic RALF peptides control an intergeneric hybridization barrier on Brassicaceae stigmas. Cell (2023) doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.09.003. 5. Ding, W. et al. Computational design and genetic incorporation of lipidation mimics in living cells. Nature Chemical Biology 1–10 (2023) doi:https://doi.org/10.1038/s41589-023-01400-8. 6. Wang, Y. et al. DNA polymerase POLD1 promotes proliferation and metastasis of bladder cancer by stabilizing MYC. Nature Communications 14, 2421 (2023). 7. Tong, Y. et al. Programming inactive RNA-binding small molecules into bioactive degraders. Nature 618, 169–179 (2023). 8. Zhang, Y. et al. Light-triggered site-directed RNA editing by endogenous ADAR1 with photolabile guide RNA. PubMed 30, 672-682.e5 (2023). 9. Liu, Y. et al. Structures of human TR4LBD–JAZF1 and TR4DBD–DNA complexes reveal the molecular basis of transcriptional regulation. Nucleic Acids Research 51, 1443–1457 (2023).