ADC藥物的質量控制和藥代PK

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ADC的制造

基本要求：

ADC的制造主要包括單抗制備、連接子制備、小分子藥物制備、ADC偶聯、純化及成品生產等過程。連接子和小分子藥物可能會作為連接子-小分子藥物中間體生產，在這種情況下，連接子和小分子藥物的要求也適用于其連接子-小分子藥物中間體。ADC具有復雜的質量屬性，應在充分了解質量屬性及臨床應用目的的基礎上，以“質量源于設計”和“風險評估”等原則和理念，確定相應的生產工藝和質量控制策略。對每一步工藝步驟進行充分開發和優化（如采用Design of Experiment，即DOE的方式），根據對關鍵質量屬性的影響確定關鍵工藝步驟和工藝參數范圍，并通過建立有效的“質量管理體系”，保證制品的安全性和有效性。

生產用原材料的控制

單抗

ADC的單抗生產及控制應依據“人用重組單克隆抗體制品總論”及“人用單克隆抗體質量控制技術指導原則”，采用現有先進的分析手段，從物理化學、免疫學、生物學等角度對制品進行全面的分析，并提供盡可能詳盡的信息，以反映目標產品的質量屬性。抗體特性分析至少包括理化異質性、結構完整性、氨基酸序列、高級結構、糖基化修飾、二硫鍵、生物學活性和免疫學特性等。

連接子2.3.2.1 連接子的制備

適用于化學全合成或半合成的連接子的研制，研制工藝應可控、穩定，能夠實現工業化生產，同時，保證產品質量的穩定性和批間一致性。連接子的質量，如正確的結構、純度及雜質種類等會影響其與單抗或小分子藥物的連接，應針對關鍵工藝參數進行充分的研究，可參考《化學藥物原料藥制備和結構確證研究的技術指導原則》和ICH Q11中的相關內容進行。研究的基本內容包括工藝的選擇、工藝參數的控制、起始原料和試劑的要求、工藝數據的積累、工藝的優化與放大、雜質的去除和控制等。

起始原料應根據對連接子或連接子-小分子藥物質量的影響程度以及工藝研究結果制定相關質量要求。對由起始原料引入的雜質及異構體，必要時應進行相關的研究并提供質量控制方法；對具有手性的起始原料，應對對映異構或非對映異構雜質進行監測，并在充分認識工藝后確定適當控制點和可接受限度。

連接子的質量控制

連接子的質量控制應按照產品工藝特點和終產品質控的需要合理選取質控項目并設定限度。通常質控項目應包括外觀性狀、結構確證、理化性質（如熔點、沸點、比旋度、溶解度等）、純度檢查（如有關物質、異構體）、含量測定、細菌內毒素、有機殘溶測定等。針對含有手性中心的連接子，應根據相關要求進行手性研究。對未知雜質應進行限度控制。另外，連接子的穩定性研究也非常重要，為其擬定的保存條件和有效期提供依據。

小分子藥物

1）小分子藥物的制備

適用于化學全合成或半合成以及從動物、植物、微生物中提取的小分子藥物的研制。研制工藝及要求與“連接子的制備”基本一致，可參考《化學藥物原料藥制備和結構確證研究的技術指導原則》和ICH Q11中的相關要求。另外，考慮到小分子藥物及試劑等的毒性，應安放相應的防護設備，并制定相應的防護和應急處置措施，同時，應有廢棄物的處理方案。

2）小分子藥物的質量控制

應根據小分子藥物的結構特征、理化特性和最終產品的質控需要制定相關質控策略，考慮包括制備過程所用的起始原料及試劑、制備中間體及副產物，以及有機溶劑等因素對最終產品質量的影響。應對小分子藥物、連接子-小分子藥物進行化學結構和組分的確認，并在其基礎上進行相應的質量研究。結構確證研究可包括紅外、紫外、核磁共振（碳譜、氫譜，必要時進行二維相關譜）和質譜等研究。質量研究應包括性狀、鑒別、檢查和含量測定等幾個方面。應重點關注可偶聯雜質和手性異構體，對未知雜質進行限度控制。對于含有手性中心的小分子藥物，應對其起始物料及合成中間體進行質量控制，并根據需要對終產品進行手性異構體分析研究。另外，小分子藥物的穩定性研究也非常重要，可為其擬定的保存條件和有效期提供依據。

性狀

對其外觀進行描述，包括狀態（如固體、液體）和顏色。若任何一種性質在貯藏時發生變化，應進行調查，并采取相應的措施。對具有光學活性的小分子藥物，還應根據情況考慮進行旋光度或比旋度測定。

鑒別

應采用專屬性強、靈敏度高、重復性好和操作簡便的方法，常用的方法有化學反應法、色譜法和光譜法等。

檢查

通常應考慮小分子藥物對ADC安全性、有效性和穩定性三個方面的影響。檢查項目可考慮一般雜質（如：氯化物、硫酸鹽、重金屬、砷鹽、熾灼殘渣等）、有關物質、溶劑殘留、晶型、干燥失重或水分、異構體等。在既定的工藝生產和正常貯藏過程中可能產生需要控制的雜質，包括工藝雜質、降解產物、異構體和殘留溶劑等，因此，要進行充分的質量研究，并結合最終產品需要制定小分子藥物的雜質控制項目。

含量測定

在適宜開發階段，可選擇專屬性強，精密度、準確性良好，能反映產品穩定性的方法測定其含量。

生產過程的控制

ADC的生產過程較為復雜，為保證最終得到質量可控、批次間一致性較高的產品，應對關鍵原材料設置質量標準和有效期規定，包括單抗、連接子和小分子藥物。如需貯存中間產物，應對中間產物的貯存條件進行相應的穩定性研究。

單抗生產

單抗的細胞培養和收獲、純化和原液生產的要求均可參照“人用重組單克隆抗體制品總論”。

ADC偶聯工藝

1）抗體結構修飾

抗體通過生物或化學反應，形成特定的活化基團以便后續的偶聯反應即為抗體的結構修飾。抗體與小分子藥物的偶聯分為非定點偶聯和定點偶聯。非定點偶聯通常是通過抗體分子上賴氨酸的氨基或半胱氨酸的巰基與小分子藥物連接；而定點偶聯則是通過對抗體分子進行修飾改造，如在特定位點引入半胱氨酸或包含特殊結構的非天然氨基酸，也可通過生物酶將特定氨基酸脫糖等形成特異的偶聯位點，從而將小分子藥物連接到抗體的特定位點上。

根據反應類型不同，應考察反應體系中的不同指標，如反應濃度、投料量、溫度、時間、緩沖體系、pH、有機助溶劑種類或用量等對終產品的影響，設定合理的中控檢測（如細菌內毒素等），制定合理的工藝控制范圍，通過不斷積累確定最終工藝條件。另外，在工藝開發的合適階段還應對反應體系與容器的相容性進行研究。

2）偶聯反應

通過生物或化學反應，將小分子藥物與抗體上的活性基團進行連接形成完整ADC分子的過程即為偶聯反應。與抗體結構修飾的過程要求一致，應考察反應體系中反應濃度、投料比例、溫度、時間、緩沖體系、pH、有機助溶劑種類與用量等參數對終產品的影響，設定合理的中控檢測（如DAR、SEC、細菌內毒素等），制定合理的工藝控制范圍，通過不斷積累確定最終工藝條件。另外，在工藝開發的合適階段還應對反應體系與容器的相容性進行研究。

3）ADC提取和純化

制品的提取和純化應采用證明能夠有效去除偶聯反應中工藝相關和制品相關雜質的工藝進行。工藝相關雜質，包括殘留的還原劑、氧化劑、催化劑、反應酶、有機溶劑等；制品相關雜質，包括游離的連接子、小分子藥物、連接子-小分子藥物中間體、未偶聯抗體和ADC聚合體等。此外，還應注意控制工藝過程中的微生物污染（如細菌內毒素等），并在工藝開發的合適階段評估純化緩沖液與接觸材料的相容性。

4）ADC原液

純化后的ADC經處方配制和過濾后分裝于中間儲存容器中，即成為ADC原液。原液貯存應注意研究原液與容器的相容性、原液的穩定性及保存時間，并確定貯存條件和有效期。

5）ADC成品

原液或半成品經除菌過濾后分裝于無菌終容器中并經包裝后即為成品。將分裝后的無菌容器密封，以防污染，如需冷凍干燥，先進行冷凍干燥再密封。

質量控制

ADC具有比單抗更復雜的結構和更特殊的質量屬性。質量控制策略應基于對關鍵原材料（單抗、連接子、小分子藥物等）的質量評價、對終產品關鍵質量屬性的理解以及對工藝認識的不斷積累，結合風險評估手段綜合制定。

1）單抗質量控制

參考“人用單克隆抗體質量控制技術指導原則”及“人用重組單克隆抗體制品總論”相關技術要求。一般情況下，必須對抗體進行充分鑒定。應根據關鍵質量屬性、對單抗質量和工藝理解認識的積累以及風險評估的原則，制定適當的質量控制策略。另外，還需對可能影響偶聯工藝的質量屬性進行充分的研究和適當的控制。

2）ADC質量控制

特性分析

ADC的全面特性分析應采用適宜的、先進的分析技術，從理化性質、免疫學特性、生物學活性和雜質等角度進行全面細致的分析，并結合對裸抗的特性分析充分了解偶聯前后的相關特性變化，提供盡可能詳盡的信息以反映終產品的質量屬性，同時，為制品質量標準的建立提供依據。特性分析至少應包括以下范疇：

理化性質

單抗通常具有復雜的異質性（如糖基化和其他翻譯后修飾等）。單抗本身的異質性及偶聯造成的異質性的疊加會導致ADC的復雜程度大幅提高。對于具有高度異質性的ADC（即使是利用定點偶聯技術的產品），需采用具有足夠分辨率的可靠分析方法進行全面分析，以闡明制品相關物質的多樣性。應根據小分子藥物和連接子的化學性質、偶聯方式（氨基偶聯、巰基偶聯、定點偶聯等）以及產品的復雜性選擇合適的特性分析方法。

ADC的理化性質分析通常包括評估偶聯工藝對抗體一級結構的影響、確定藥物主要偶聯位點、藥物抗體偶聯比（DAR）和藥物載藥量分布、分子大小變異體、電荷變異體以及高級結構分析等。

一級結構和藥物偶聯位點

采用適當方法，如肽圖譜法和質譜分析法，評估偶聯工藝對單抗一級結構（如氨基酸序列完整性、二硫鍵連接）、糖基化修飾和翻譯后修飾等的影響。如果采用的偶聯工藝過程已證明不會影響糖基化修飾，則偶聯后的ADC可以不重復進行糖基化修飾相關特性分析。此外，還可利用質譜法對ADC中小分子藥物與單抗的主要偶聯位點進行鑒定和分析。

DAR

DAR是ADC重要的質量屬性之一，直接影響其安全性和有效性。它表示每個抗體分子上偶聯的小分子藥物的平均數量。根據連接子、小分子藥物的化學性質以及偶聯方式選擇分析手段，常用的方法包括紫外-可見分光光度法（UV）、疏水色譜法（HIC-HPLC）、反相色譜法（RP-HPLC）、質譜法（MS）等。

藥物載藥量分布

ADC，尤其是采用非定點偶聯方式的ADC，通常是包含了連接不同數量小分子藥物的ADC分子混合物。藥物載藥量分布表示偶聯有不同數量小分子藥物的ADC分子分別占總的藥物分子的比例。應采用適當方法，如疏水高效液相色譜（HICHPLC）、反相高效液相色譜（RP-HPLC）、毛細管電泳（CE）或質譜法（MS）等，鑒定不同載藥量組分的分布（如，含有0、1、2、……、n個藥物的抗體組分）。

分子大小變異體

與人用單抗產品相同，應采用適宜的方法，如分子排阻色譜法（SEC-HPLC)、非還原型和還原型十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）、十二烷基磺酸鈉-毛細管凝膠電泳（CESDS）和分析型超速離心（AUC）等多種方法對ADC的分子大小變異體（即聚合體和片段）進行適當鑒定。需要特別關注聚合體，因為許多與抗體偶聯的小分子藥物具有較強的疏水性，可能會增加生產和貯藏期間聚合體的形成。

電荷變異體

對于單抗，通常采用毛細管區帶電泳（CZE）、離子交換色譜（IEX-HPLC）、毛細管等電聚焦電泳（CIEF）或成像毛細管等電聚焦電泳（iCIEF）等適當方法測定電荷變異體。這些方法對ADC分析的適用性取決于連接子-小分子藥物的特性（尤其是電荷）以及偶聯位點的選擇（如賴氨酸、鏈間巰基、碳水化合物等）。雖然IEXHPLC法是測定抗體電荷變異體的常用方法，但由于小分子藥物多位點連接的可能性以及與色譜柱固定相之間潛在的非特異性相互作用，該方法可能不適用于非特異性偶聯ADC電荷變異體的分析。

在某些情況下，通過賴氨酸殘基偶聯ADC的電荷異質性分析可能不可行或無意義。例如，通過賴氨酸殘基連接不帶電荷的連接子-小分子藥物后，每連接一個連接子-小分子藥物會導致ADC的凈正電荷減少一個。在這種情況下，基于電荷的分離方法只能分析賴氨酸偶聯的ADC的載藥量圖譜，而無法反映單抗藥物本身的電荷異質性。采用其它表征方法（如肽圖譜）來評估偶聯對抗體本身電荷異質性的影響可能更有意義。

高級結構

蛋白質的高級結構由氨基酸序列和翻譯后修飾共同決定的，因此，蛋白質一級結構的確證是研究其結構特性的基礎。用來直接評估ADC分子共價結構的理化方法詳見“3.2.1.1.1”節~“3.2.1.1.5”節。

傳統的生物物理學方法如圓二色光譜（CD）、差示掃描量熱法（DSC）、動態光散射（DLS）和傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）等可用于鑒定ADC的生物物理學性質。然而，由于抗體或ADC為生物大分子，往往限制了上述方法（如CD和FTIR）檢測結構異質性的能力，達不到理想的靈敏度。在研究ADC產品時，其各組分的存在可能會使結果分析復雜化。

此外，ADC的高級結構還可通過生物學功能確證（“3.2.1.2”節）。生物學活性是對高級結構的確證，其它能夠反映產品功能活性的體內或體外生物活性檢測方法，也可以作為高級結構的補充確證方法。

免疫學性質和生物學活性

對于ADC產品，應采用適當方法（如ELISA或表面等離子體共振法等）來評估偶聯對抗體免疫學性質（如抗原結合活性）的影響。ADC應保持其與目標抗原結合的特異性及各批次之間結合活性的一致性。

ADC的主要作用機制是通過抗體與細胞外靶抗原結合，被細胞內吞，然后利用小分子藥物殺死細胞。應通過細胞殺傷測定法證明靶點依賴性細胞毒性（生物學效應），對該作用機制進行證實。

對于抗體，Fc介導的效應子功能可能在作用機制中起作用并對產品安全性和有效性產生影響。對于ADC，由于與細胞內吞的競爭效應，Fc介導的效應子功能可能對抗腫瘤作用無顯著影響。但是，如果Fc介導的效應子功能顯示有可能與ADC的臨床活性相關，則應進行基于細胞的生物活性測定或其它可以反映效應子功能的測定。

工藝相關雜質和污染物

1）工藝相關雜質

應鑒定潛在的工藝相關雜質（如游離小分子藥物及其相關物質、殘留溶劑及重金屬等），并根據情況進行定性和/或定量評價。對于ADC中殘留游離小分子藥物的測定可以先沉淀蛋白質（包括ADC分子上偶聯的小分子藥物），然后采用能夠檢測小分子藥物的方法分析上清液中殘留的游離小分子藥物，也可采用其它樣品制備方法。游離小分子藥物殘留量應結合相關小分子藥物的藥理毒理特性及藥物最大使用劑量，設定合理的限度標準。

2）污染物

應嚴格避免和/或適當控制污染物，包括所有偶然引入的、且不屬于生產工藝預期使用的物質（如微生物、內毒素等）。

3）含量

建議采用適宜的物理、化學或免疫學方法測定含量。如測定ADC的消光系數后，采用分光光度法在280 nm處測定蛋白濃度。對于ADC，除多肽骨架外，還應考察小分子藥物或連接子-小分子藥物對280 nm處吸光度測量值的潛在貢獻，如發現明顯干擾，在供試品濃度計算中應納入適當的校正因子。

4）制品檢定

與其他人用重組DNA蛋白制品相似，ADC原液及制劑的檢定需要考慮其鑒別、純度、含量和效價等。然而，由于ADC的結構復雜性以及小分子藥物的存在，需要特別考慮某些特定的性質，某些主要源于抗體的質量屬性（如糖基化和其他翻譯后修飾等）應在抗體的生產和檢定時進行適宜的控制。

ADC常規放行質量控制項目與可接受限度，應結合代表工藝的多批次樣品的數據、生產批次間一致性的數據以及穩定性研究數據等綜合確定。ADC制品的質量檢定應至少包括以下項目。

5）鑒別

鑒別檢查方法應基于產品分子結構和/或其他特性的高度專屬性。鑒別檢查方法必須對ADC產品具有足夠的專屬性，以證實其產品含有兩種必需成分（抗體和小分子藥物）。基于產品特性，可能需要采用一種或多種理化、生物學和/或免疫化學檢查方法進行鑒別。

6）DAR和藥物載藥量分布

應測定DAR，并設定可接受標準，檢測結果應在規定范圍內。另外，還應包括藥物載藥量分布特征的定性評估。

7）純度和制品相關雜質

如特性分析章節所述，ADC可能具有復雜的純度/雜質特征，需要通過正交組合的方法進行評估，并確定制品相關變異體的單獨和/或總體可接受標準。

通過精確和可靠的方法測定分子大小變異體，以測定ADC中的聚集和片段化程度。如果可能，還應采用適當方法測定電荷變異體。

工藝相關雜質

在控制策略中，應包含工藝相關雜質的控制方法。在某些情況下，經合理論證后可以在適當步驟中對偶聯工藝中的關鍵雜質進行檢查以達到雜質控制的目的。

游離小分子藥物和偶聯溶劑殘留的質量控制通常會納入制品質量標準中，檢查結果必須符合規定的限度。

效價

效價是一個基于產品生物學特性的定量測定指標。效價測定應包含在原液和制劑的質量標準中，效價測定方法應盡量反映臨床相關的生物學活性。

應根據ADC的作用機制，建立基于細胞殺傷的ADC生物學活性測定方法，以證明其具有靶點依賴性的細胞毒性。如靶點結合測定法（如ELISA、表面等離子共振等）可提供更多的產品質量信息，在經過驗證后也應將其納入常規放行檢驗。

每批原液和制劑的效價均應采用適當的國家標準品、國際標準品或參比標準品來確定。尚未建立國家或國際標準品的，應采用經批準的經過充分表征分析的內控參比品。標準品和參比品的建立及制備均應符合“生物制品國家標準物質制備和標定規程”。

含量

應采用適宜方法測定原液和成品的含量。

安全性試驗

無菌、細菌內毒素和生物負荷檢查應符合要求，參見“人用重組單克隆抗體制品總論”相關要求。異常毒性檢查應結合ADC的毒理學數據和臨床給藥劑量，評估該項檢查的適用性、合理性和可操作性。

其它檢測項目

應合理評估外觀（例如性狀、顏色、澄清度等）、可見異物、pH值、滲透壓、裝量/裝量差異、不溶性微粒等，凍干制劑還應考慮復溶時間、水分等。

穩定性評價、儲存和有效期

ADC穩定性評價應依據《生物制品穩定性研究技術指導原則》要求進行，并應符合“生物制品貯藏和運輸規程”規定。穩定性評價的類型包括長期穩定性、加速穩定性及強制穩定性，由于長期穩定性的研究條件為ADC產品的實際儲存條件，其間出現的降解途徑和降解產物（包括單抗部分和小分子藥物部分）也是產品中真實存在的，因此是最基本的穩定性研究。儲存條件和有效期的設定應根據長期穩定性研究的結果進行合理設定。產品應在規定的環境條件下貯存和運輸。自生產之日起，按批準的有效期執行。

ADC的藥代動力學（PK）評價

由于ADC結構的復雜性、多樣性，以及生物樣本中釋放的小分子藥物含量較低等特殊性，給藥代動力學研究帶來了諸多挑戰，主要體現在藥代動力學特征、藥動-藥效相關性、目標分析物質、生物分析方法和數據解釋的復雜性和多樣性。

根據ADC特異性，建議采用相關動物種屬進行單次和多次給藥的藥代動力學研究。當受試物ADC無相關種屬或僅非嚙齒動物為相關種屬時，可以僅在非嚙齒動物體內進行藥代研究。不同種屬動物間藥代動力學的差異，對預測毒性試驗的量效關系有明顯差別。具體試驗應根據藥物特征，遵循case-by-case原則開展。藥代研究用ADC受試物的制劑、濃度、給藥方式，應盡可能與安評試驗或者臨床試驗用受試物一致，并在研究時進行給藥制劑的濃度確認。

常用于表征ADC PK特征的分析物包括：1）完整的ADC和/或總抗體（偶聯和未偶聯藥物的抗體即總抗體，以及至少偶聯一個藥物的抗體），如果抗體與ADC競爭結合靶點，那么檢測抗體也具有一定的意義；2）游離小分子藥物和/或裸抗。

ADC的PK研究主要考察項目包括ADC的穩定性、血藥濃度-時間曲線、吸收、分布、代謝及排泄（ADME）過程。如果小分子藥物是新化合物，建議綜合應用體內外研究方法，定性和/或定量檢測手段，對小分子藥物的系統暴露量、血漿蛋白結合及排泄特征、腫瘤和正常組織的攝取/分布特征等進行詳細研究。必要時，對小分子藥物代謝產物進行系統暴露量、代謝產物譜、分布、脫落方式、斷裂點等系統研究。可通過檢測小分子藥物的脫落量對ADC進行體外血漿穩定性和動物體內的代謝穩定性研究。另外，建議考慮連接子的穩定性對小分子藥物非預期提前釋放及其對藥代和藥效、毒性等的影響。

ADC的PK分析方法包括檢測抗體的配體結合分析及檢測小分子藥物及代謝產物的LC-MS/MS等方法。有些情況下，傳統檢測方法難以滿足ADC中抗體分子準確生物分析和小分子藥物體內濃度分析低檢測限的需求，需要應用有效的、高靈敏度和寬線性檢測范圍的生物分析方法，評價ADC在體內穩定性和代謝特征。ADC生物分析方法建立和驗證時需要考察DAR對檢測結果的影響，必要情況下監測體內DAR動態變化。建議在ADC的藥代動力學研究中伴隨開展ADA檢測，以輔助解釋藥代研究數據。