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【微學堂】Z因子：高通量實驗評估和驗證的有力工具（內含視頻教程）

美谷分子儀器

2020.7.17

本文字數：2796字

閱讀時間：10分鐘

視頻時長：4分19秒

1999 年，Zhang 等人首次提出了一個簡單的統計參—— Z 因子，自此之后，Z 因子成為高通量篩選（HTS）實驗評估和驗證中使用最廣泛的參數。它為任何生物測定法，尤其是 HTS 測定法的質量分析，提供了一種簡便而有用的度量標準。

Z 因子的由來

高通量篩選技術（HTS）是 20 世紀 80 年代后期發展起來的一種藥物篩選的新技術，逐漸成為新藥發現中必不可少的過程。能夠準確，快速地從大型化學物庫中鑒定活性化合物（“Hits”）的能力在很大程度上取決于篩選中使用的測定方法的適合性或高質量。

由于每種測定方法的性質以及由儀器和人為相關的隨機誤差引起的擾動，測定中的所有測量值都包含一定程度的可變性，客觀上，測量變化越小，所鑒定出的 Hits“真實”的置信度就越高。

因此，在設計和驗證 HTS 分析時，引入標準偏差（SD）或變異系數（CV）等指標作為參考標準，能大大增加測定方法的可靠性。在當時，有兩種指標用來寬松地表示測定的質量：一個是信號與噪音的比值（S/N），另一個是信號與背景的比值（S/B）。

S/N 的表達式定義為：

S/N=(mean signal-mean background)/SD of background,

根據這個定義，S/N 僅表示可以將信號視為真實的置信度，即與相關的背景噪聲不同；第二個S/B的表達式定義為：

S/B=mean signal/mean background

這兩個指標都沒有充分考慮到樣品和背景測量的可變性以及信號的動態范圍，因此都不能很好的反映測定質量。

直到 1999 年，Zhang 等人定義了一個“Z因子”作為度量標準，該系數既反映了測定信號動態范圍，又反映了與信號測量相關的數據變化，因此適用于測定質量評估。

Z 因子是無量綱的參數，因此適用于不同測定分析的比較。Z 因子不僅為比較和評估分析的質量提供了有用的工具，還可用于分析的優化和驗證。

Z 因子的方程式

通常在驗證典型的 HTS 分析時，將未知樣品與參考對照一起進行分析。

樣品信號是指給定測試化合物的測量信號；陰性對照（通常稱為背景）是指來自提供最少信號的對照孔的一組單獨測定；陽性對照是指來自提供最大信號的對照孔的一組獨立測定。

在驗證測定中，運行包含陽性和陰性對照的多個測定板，評估在活性范圍的兩個極端情況下的可重復性和信號變化，然后計算它們各自的樣品、陽性對照和陰性對照的均值和SD，其中陽性對照平均值與陰性對照平均值之間的差異定義了測定信號的動態范圍。

由此Z因子的方程式定義為：

對于激動劑/激活類型的實驗分析，方程式中的對照數據將替換為陽性對照（最大活化信號）數據；對于拮抗劑/抑制類型的實驗分析，方程中的對照數據用陰性對照（最小信號）數據代替。其中分母上的 I mean of sample-mean of control l 定義了篩選的可用動態范圍，并且是兩個信號均值的差值的絕對值。

Z 因子對數據可變性以及信號動態范圍都敏感。例如，當（3 SD of sample + 3 SD of comtrol）接近零，即非常小的標準偏差，或者當 I mean of sample-mean of control l 接近無窮大時，Z因子趨于統一（Z 的最大值），這是 HTS 分析接近理想的分析，這與人們的直覺一致，即“好”的測定法具有較大的動態范圍和/或較小的數據可變性。

對于任何 HTS 測定系統，Z 因子可以是小于或等于 1 的任何值（-∞<Z <= 1）。Zhang 等人給出了一個篩選試驗各自 Z 因子值的簡單比較（表 1），在 0.5≤Z<1 的情況下，測定系統中樣品信號分布與參照信號分布的分離程度良好，這表明此分析方法非常好；0 <Z <0.5 表示中等程度的分布分離，表明可進行分析；Z = 0 表示分離差，是“是/否”類型的測定；對于 Z <0，基本上不可能進行篩選。

表 1. 根據 z 因子的值對篩選分析質量進行簡單的分類

Z’ 因子的定義和方程式

影響分析質量的因素不僅包括儀器和實驗條件（如試劑、方法等），還包括日常的環境和不同用戶操作方面的差異，這些對信號及信號變化產生影響的條件要進行測定優化，以確保測定形式可以正確實施，并且測定將具有足夠的動態范圍和可接受的信號可變性，并能提供有用的數據。在測定方法的分析開發中，可以僅使用陽性對照和陰性對照來進行計算 Z’ 因子。

Z''因子類似地定義為：

Z'' 因子是測試本身質量的特征參數，無需測試化合物的干預。因此，Z'' 因子是任何給定測試的統計特征，不限于 HTS 測定。對于所有帶有適當選擇的陽性和陰性參照對照的大型數據，都是 Z <= Z''。Z'' 因子可用于分析開發和優化中的質量評估。

例如，如果 Z'' 值很小（負值或接近零），則通常表示測定條件沒有得到優化，或者設置的測定形式不可行，無法生成有用的數據。例如在藥物篩選實驗中，在相同條件下對相同測定的 Z’ 和 Z 值進行比較，可以看出化合物庫對測定的影響。

如果 Z'' 值大但 Z 值相對較小（ Z'' 和 Z 都大于 0 ），則可能表明化合物庫和/或用于篩選的化合物濃度需要進一步檢查或優化。因此，Z'' 因子適合評估整體測定質量，而 Z 因子則反映了針對已定義了篩選條件的特定HTS的質量。

單個 Z'' 因子的測量不足以對測定質量進行最終評估。在實際應用中，應進行三個或更多 Z'' 因子的測量，最好由不同的操作人員在不同的日期進行，以獲得對總體測定質量的準確評估。

Z'' 因子實驗還可用于跟蹤測定質量的變化，或確定對測定不可避免的變化的影響，例如試劑供應商的變化。

綜上所述，在評估，比較和驗證任何生物測定法，特別是 HTS 測定法時，都可以使用Z因子。在 HTS 分析設計之初，盡管還需要考慮其他方面例如試劑的可用性，篩選的時間線和成本等，Z 因子仍然可以作為確定 HTS 檢測適用性的簡單而有用的參數，尤其是在實驗開發時，Z‘ 因子還可用于分析評估和驗證。

如何使用 SoftMax Pro 軟件中的

Z 因子測定模板

*視頻時長：4’19”

**流量預警：9.1MB

關于 Z 因子的測定，在 SoftMax Pro 軟件的程序庫中可以找到相應的模板，具體路徑是點擊 Protocol Manager—Protocol Library—Assay Development—Z factor Assay Development，打開這個模板，首先我們看到的是對這個模板的使用介紹。

在本模板中，Z 因子有兩種測定形式，一種是需要加入未知樣本，采用樣本的最高信號值和最低信號值以及它們的標準方差進行 Z 因子的計算；一種是不需要加入未知樣本，只需要陽性對照和陰性對照，采用陽性對照的信號值和陰性對照的信號值以及它們的標準方差進行 Z‘ 因子的計算。對于 Z 因子和 Z’ 因子的詳細介紹可以看微信文章中的內容。

下面具體講一下怎么使用這個模板，首先打開 Plate1 ，如果做整板測試，需要在 setting 里，更改一下讀板區域，選擇全板。

這個模板默認的是熒光檢測模式，在實際應用中，可以選擇任何的檢測模式。點擊 OK，退出設置界面。

為了更好的說明這個模板，我從 Excel 里導入一組數據進來，復制數據，點擊任一孔，右擊，粘貼數據。

我需要對這組數據進行樣品分組，點擊 Template Editor，我的數據中第一列是陽性對照，選擇陽性對照組（PosC），點擊確認（Assign）。

第 2-11 列是我的樣本組，選擇樣本（Sample），我的樣本組是有濃度梯度的，初始濃度 3000uM，5 倍稀釋。

最后一列是陰性對照，點擊確認，點擊OK，這就分好組了。

在左側下面的陽性對照，和陰性對照的數據表格中，平均值和標準差都已經計算出來了。

在樣品表格中，AVG 是信號值的平均值，SD 是信號值的標準差，這一組（AvgActivation）是激活效率百分比的平均值，根據樣品的濃度和激活效率百分比可以進行曲線擬合。

這個模板中，使用的擬合方式是四參數曲線擬合，在實際應用中，可以在擬合方式列表中，選擇其它的擬合方式。

在 Results note 里，Z 因子和 Z‘ 因子的測定結果已經出來了，只要 Z 因子和 Z‘ 因子大于 0.5，這個實驗方法和測試條件就是成立的。適合于四參數擬合的數據，可以直接得出 EC50 值。

好了，今天的微學堂關于 Z 因子的測定模板的講解就到這里了，謝謝大家。

參考文獻

Zhang, Ji-Hu., Chung, T.D.Y. and Oldenburg, K.R., A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal Biomolecular Screening 4:67-73 (1999).