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簡析幾類熱點疫苗的工藝及質控技術

丹納赫生命科學

2022.5.06

疫苗是以病原微生物或其組成成份、代謝產物為起始材料，采用生物技術制備而成，用于預防、治療人類相應疾病的生物制品。用于傳染病預防的疫苗，在使用基因工程技術制備疫苗之前，按照其病原體來源可分為病毒類疫苗和細菌類疫苗。

在病毒類疫苗中又會根據其制備工藝分為滅活疫苗（如流感、狂犬疫苗等），減毒疫苗（如水痘、麻疹疫苗等）及亞單位疫苗。在細菌疫苗中，根據成份不同又可分為以百白破疫苗為代表的毒素類疫苗和以細菌多糖制備的疫苗如流腦、肺炎疫苗等。上述的疫苗無論是細菌疫苗還是病毒疫苗在這里我們統稱為傳統疫苗。

相對于傳統疫苗，則是使用基因工程技術制備出來的新型疫苗如：重組蛋白疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗等，是選擇不同的表達系統，將天然抗原或病原體不理想的疫苗抗原，通過基因工程技術加以人工改造，而獲得理想的疫苗抗原的方法。

1）重組蛋白疫苗

重組蛋白疫苗的工藝，在上游細胞培養過程中，高效的一次性生物反應器能為懸浮細胞培養提供穩定可靠的條件，同時節省了批次間輪換的時間，更大程度的提高生產效率并降低交叉污染風險。下游純化使用Cadence? SPTFF 超濾應用切向流過濾敏感蛋白，膜層析純化目標蛋白。除病毒過濾Pegasus? Prime/Pegasus? SV4，可以穩定地截留細小病毒，為工藝保駕護航。

2）類病毒顆粒VLP疫苗

如果表達系統表達的是單體或多聚體蛋白，使用物理或自動組裝成與天然病毒相似的空心顆粒作為疫苗，這被稱為類病毒顆粒（VLP），如預防人乳頭瘤病毒的HPV疫苗。

目前通常使用酵母表達系統生產VLP疫苗，因為疫苗蛋白為胞內表達，完成發酵收集菌體后，需要將酵母細胞破碎，使用澄清過濾去除細胞碎片，經過Mustang膜層析捕獲目標蛋白，寬泛流速范圍，尖銳洗脫峰優勢更加明顯。進一步精純后，超濾換液，進入制劑灌裝環節。

丹納赫生命科學旗下頗爾擁有菌液重懸破碎、澄清過濾、超濾濃縮等一系列VLP疫苗相關工藝流程的解決方案。

一般而言， VLPs均可通過自組裝形式形成獨特的結構，但不完全組裝和不規則聚合可導致VLP效力和穩定性下降，因此對有些VLP需要在不同pH值、鹽濃度、是否用還原劑等條件下去組裝或重組裝，并且進行相關檢測。貝克曼庫爾特的分析型超速離心機AUC可通過檢測不同溶液狀態下顆粒的沉降系數對戊肝疫苗HEVp239組裝情況進行分析，發現采用0.3 M（NH4）2SO4的溶液條件可完成HEVp239的有效重組裝。

同時，AUC還可以對VLP疫苗的聚集體狀態進行檢測，從而進行批間一致性評估。

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另外，SCIEX毛細管電泳還可以對HPV VLP疫苗的純度和等電點進行檢測。采用CE-SDS方法通過分子量的大小差異對HPV疫苗的純度、雜質含量進行分析，采用等點聚焦電泳cIEF方法對HPV的等電點進行檢測，從而對組裝情況進行分析。

3）多糖及多糖結合疫苗

隨著疫苗研制技術發展，上述提到的傳統疫苗中的細菌多糖疫苗，為了提高其免疫效應，使用化學方法將蛋白成份與多糖結合，制備出多糖結合疫苗，可增加嬰幼兒對細菌多糖的免疫效應。

其工藝主要流程是上游經過細菌發酵，收集菌體，加入滅活劑進行脫毒處理后，使用深層過濾方法以保證過程的生物符合。使用Omega T超濾系統濃縮降低收獲液體積并去除小分子蛋白，經過澄清過濾攔截大分子及有形雜質后，重復經過超濾和澄清過濾，完成多糖的制備。此時，可以進行多糖疫苗的制劑灌裝。結合疫苗則進入蛋白結合步驟，此步驟主要使用化學方法將蛋白與多糖結合，過程中除了結合的目標產物外，還會產生游離多糖和蛋白，一般采用超濾和層析方法去除。在制劑灌裝階段使用Allegro一次性配液灌裝系統，可以提高批件切換效率，避免不同血清型原液的交叉污染。

頗爾也擁有多糖及多糖結合疫苗一系列相關工藝流程的解決方案。

多糖結合疫苗由于是通過化學方法將蛋白與多糖結合，因此需要對生產/加工后的大分子完整性進行監測。貝克曼庫爾特的分析型超速離心技術（AUC）現在被認為是評估分子完整性和聚集體的重要技術，可以對蛋白質和細菌多糖組成的的大型糖綴合物分子量分布進行檢測，從而分析多糖結合疫苗的完整性情況。

多糖蛋白結合物中游離多糖含量過高會導致疫苗中有效的抗原含量降低，對臨床效果產生不利影響。另根據歐洲藥典的要求，也需要對多糖蛋白結合物中的游離多糖的含量進行測定。因此，游離多糖含量也是產品質量控制中的一個重要檢測項目。使用SCIEX的PA 800 Plus制藥分析系統可對多糖結合疫苗中的游離蛋白進行分離及定量。