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工程細胞株開發系列之表達系統對比

丹納赫生命科學

2022.1.20

?細胞株開發是抗體藥物CMC的起點和基礎，細胞株的好壞直接決定生產成本、工藝復雜度和產品質量。一個好的細胞株有多方面要求：

1.產量高：可降低固定投資和單次生產成本。

2.產品質量符合要求：產品質量影響藥效和安全性，而這兩項是IND和NDA的關鍵。

3.穩定性高：產量和質量在生產傳代過程中不應有大的改變。

4.可放大性：細胞株需要適合大規模生產放大。

5.合規性：保證單克隆源性以及實驗記錄完整性。細胞株的構建過程應避免接觸或使用動物來源成分或其它可能影響安全性的成分。

工程細胞株開發第一步就是需要考慮采用何種表達體系。宿主細胞系直接影響產品的特定屬性，比如糖基化、羧基化、羥基化、酰胺化等；甚至還可能影響半衰期、免疫原性和生物學活性。宿主細胞系應完整表征，有著完整的記錄，不含TSE/BSE等病毒污染因素。宿主細胞應適合無血清培養基，或者無動物來源成分的培養基中懸浮生長。

表達體系的區別

微生物表達系統

Part 1

早期生物藥以微生物表達系統為主，因為哺乳動物細胞培養基成本高、產量低，需要加入血清，存在安全隱患。微生物生產系統主要包含：大腸桿菌、酵母、假單胞菌和芽孢桿菌。大腸桿菌系統研究較早，機制了解透徹，不存在動物來源污染的風險。大腸桿菌生長速率高，倍增時間僅為20-30分鐘，營養要求簡單，因此生產成本很低。可用于胞內表達或分泌表達，胞內表達既可以是可溶性蛋白，也可以是以包涵體形式存在的不可溶蛋白。但是大腸桿菌最大的劣勢就是翻譯后修飾不足和大分子蛋白表達困難。

酵母表達系統優勢：生長速度快，培養成本低，可以表達分泌性產品。酵母為真核表達，因此正確折疊蛋白能力與翻譯后修飾（信號肽切割，二硫鍵形成，亞基組裝，乙酰化和糖基化等）都是比大腸桿菌更好。但是酵母不含有哺乳動物的伴侶蛋白，因此需要進行人源基因改造后才能表達人類蛋白。

目前市場上微生物系統表達的產品有：人胰島素，人血白蛋白，肝炎疫苗，HBV，微纖溶酶，單抗片段等。如下圖所示，截至2014年，微生物表達系統在歐洲市場與美國市場依然占據49%的市場份額。

哺乳動物細胞表達系

Part 2

哺乳動物細胞表達體系又可以細分為人源細胞和非人源細胞。哺乳動物細胞具有和人類相似的復雜翻譯后修飾，常被用來表達具有活性的生物大分子蛋白。而這些生物大分子的功能發揮在一定程度上依賴于這些翻譯后修飾。在1984-2004年，哺乳動物細胞培養的密度增加了5倍，培養時間延長3倍，批次發酵工藝產量從100mg/L左右提高到>15g/L，采用灌流培養工藝甚至可以達到80g/L。因此在人源蛋白生產中，哺乳動物細胞培養工藝漸漸取代了微生物發酵工藝。

第一個人源細胞系是1951年建立的HeLa細胞系。在1960s，人二倍體細胞被用于疫苗生產。但人們對致癌病毒的擔心使人源細胞能用于商業化生產的種類較少，上市產品只有人胚胎腎細胞（HEK293）,纖維肉瘤細胞（HT-1080）和Namalwa淋巴瘤細胞。人源細胞表達系統最大的優勢就是翻譯后修飾。

非人源哺乳動物表達系統主要包括CHO細胞，雜交瘤細胞，BHK細胞，Vero細胞和MDCK細胞。雜交瘤和BHK細胞主要用于重組蛋白生產，Vero和MDCK細胞主要用于疫苗的生產。CHO細胞在生物藥生產中占據主導地位，在2015年后獲批的藥物中，CHO細胞表達體系占據超過一半的比例。這主要是因為CHO細胞在生物藥生產中應用早、表達量高、容易處理和操作，法規接受程度高。致病性的病毒在CHO細胞中無法復制，因此CHO細胞被認為是非常安全的表達體系。CHO細胞具有較高的基因和表型不穩定性，因此有較多的細胞譜系，例如DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S等。

工業上使用較早的是DHFR體系（二氫葉酸還原酶缺陷型）DG44細胞。當細胞培養基內還有MTX（甲氨蝶呤）時，二氫葉酸還原酶被抑制，通過反饋調節，使得該基因自我擴增，連帶其上下100-1000kb的基因都會擴增，因此目的基因也得到擴增，即可以提高目的蛋白的表達量。

GS體系（谷氨酰胺合成酶）CHO-K1較DHFR系統有明顯的優越性。其原理是GS在ATP水解提供能量的同時，利用細胞內的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在谷氨酰胺缺失的培養基中加入GS抑制劑甲硫氨酸亞砜亞銨（MSX），可使GS基因及與之相連的目的基因得到有效擴增，從而達到提高目的基因表達水平的目的。該系統的優點：不需要基因缺陷型的CHO-K1細胞株做為宿主細胞；CHO-K1細胞易于培養；培養基中無需加谷氨酰胺，避免其降解產生大量銨離子，降低了工藝控制的難度，并且可有效提高細胞發酵密度和延長細胞生存時間。

除了上述兩種代謝型篩選標記，哺乳動物細胞篩選還經常使用抗生素型篩選標記，最常用的是嘌呤霉素和G418，但是單獨采用抗生素進行篩選的平臺，因篩選效率較低，多用于研究階段。總結如下：

昆蟲細胞表達系統

Part 3

昆蟲表達系統作為哺乳動物細胞表達系統的替代系統。最常見的昆蟲細胞系為SF9, SF21和SF+等。昆蟲表達系統可以用于早期研發，也可以用于工業化生產。在哺乳動物細胞表達量不高的時候，昆蟲細胞可以快速提高表達量至克級，對于藥物篩選或結構研究很有幫助。昆蟲細胞一般采用病毒感染而不是質粒轉染，昆蟲表達系統存在兩個問題導致其并未大規模商業化：1昆蟲表達系統的糖基化修飾比微生物系統有很大的進步，但是和哺乳動物細胞依然有區別；2表達量達到一定水平后很難再進一步提升。

整個工程細胞株開發過程中，在做細胞培養、轉染、篩選時，我們需要時刻關注細胞的活率和狀態，但這樣的工作人工操作時需要考驗檢測人員的眼力、耐心和專注力，有時會費時費力，而且可能會存在一定的人工誤差。丹納赫生命科學旗下貝克曼庫爾特生命科學的Vi-CELL BLU 細胞計數器以及細胞活性分析儀可以全自動進行細胞活力分析與細胞計數，無需人員之手，幫助用戶實現標準化的細胞計數和活力分析，是生物制藥行業計數和活力測試的標準分析方法之一，其軟件滿足21 CFR part 11，符合審計追蹤的要求。

另外，貝克曼庫爾特生命科學近日推出的BioLector XT新一代高通量微型生物反應器，是幫助您進行細胞篩選的利器，它可加速對包括厭氧菌在內的多種生物的培養評估，始終如一地產生高質量數據。它體積小巧，支持以48孔微孔板形式對關鍵培養參數（包括生物量、pH、溶解氧和熒光信號）進行穩健、實時的評估。隨著新產品的推出，微型生物反應器技術在自動化和高通量方面獲得極大提升。其適用于細菌、真菌和藻類等的高通量菌株篩選、培養基優化和發酵參數開發等，能顯著提高工作效率，獲得真正高質量的菌株、培養基和發酵參數等，提高放大成功率，大幅降低實驗成本，并增加新發現幾率。

本文參考資料

1.Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing processes. Günter Jagschies, Eva Lindskog, Karol ??cki, Parrish Galliher. 2018

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