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三種長片段測序方法對比
近期，由澳洲昆士蘭大學發表在bioRxiv的文章《Comparison of long read methods for sequencing and assembly of a plant genome》中，采用三種長片段測序技術Pacific Biosciences (Sequel I), Oxford Nanopore (PromethION、MinION) 和華大智造stLFR(single-tube Long Fragment Read)對夏威夷果（Macadamia jansenii）進行了基因組組裝，并分別從組裝結果的準確度、完整度、測序成本及樣本要求等四個方面進行了對比。
文庫構建和上機測序
采用15ug?DNA 構建30Kb以上的文庫用于PacBio測序，并將該文庫用sequel I測序8個SMRT cell，得到317萬條subreads，總數據量為65.2Gb，N50為35.9Kb。
基于ONT平臺構建文庫的DNA投入量為1.5ug和1.2ug，將其文庫分別在PromethION和MinION測序，得到的下機數據分別為23.2Gb和1.7Gb，reads的N50分別是28.5Kb和16.6Kb。
華大智造stLFR文庫構建從10 ng DNA稀釋液中提取1.5ng用于后續建庫，然后采用MGISEQ-2000RS進行測序，得到約74.5Gb的數據用于后續組裝。
對比上述三種長片段組裝方法可知，stLFR文庫組裝所需投入量遠低于PacBio及ONT，僅需要1.5ng即可。同時，根據表1可知，基于華大智造DNBSEQ平臺的測序成本最低，不到PacBio的十分之一。
表1 測序數據統計
數據處理和分析
在對下機數據做接頭和低質量過濾后，分別得到25Gb (ONT)、65Gb (PacBio)、74Gb (MGI)數據用于后續分析。設置k-mer為21-，23-和25-對基因組大小進行評估，已知夏威夷果的基因組大小約為616-653Mb。
分別用Redbean v2.5、Flye v2.5、Canu v1.8和Raven對ONT數據進行組裝。結果顯示Canu 和Flye能得到更大的基因組和更多的contig數，其次是Redbean (~750 Mb, contig N50 ~700 kb)和Raven (~720Mb, contig N50 ~500 kb) 。Canu在32X的contigN50為1.43Mb，遠遠大于21x下的706Kb。Flye的運算速度比Canu快5倍。
用Redbean、Flye、Canu及Falcon對PacBio數據進行組裝，結果顯示Falcon結果最好，contig N50為1.38Mb，Redbean的組裝結果最分散，完整度只有89%。Flye的組裝結果更接近Falcon，但是基因組大小只有767Mb，Canu的重復序列比例太高，組裝的基因組達到1.2Gb。
使用superNova 2.0對stLFR進行組裝，得到752 Mb 的基因組，contig N50為 35.6 kb，scaffold N50 為3.54 Mb，BUSCO評估基因組完整度為88.3%，組裝結果的mismatch和Indel最少，準確性最高。
表2 基因組組裝結果
注：表中的BGI即代表采用了基于華大智造DNBSEQ平臺的stLFR技術得到的組裝結果。
進一步地，如果使用ONT數據對組裝結果進行“補洞”，則contig N50 可以從35.6Kb提升到1.05Mb，最長的contig從518 kb 提升到9.7 Mb，gap數從24,933 降低到2,284，基因組完整性也提高了4.8%，達到了92.5%。
表3 用ONT數據對stLFR組裝結果進行“補洞”
組裝結果比較
用QUAST v5.0.2對組裝結果進行評估，并與已發表的夏威夷果基因組進行比較。為了評估堿基的準確度，用QUAST計算組裝結果里的mismatch和InDel比例，結果顯示：基于華大智造stLFR技術的mismatch和InDel均是最低的，組裝結果具有最高的準確性；ONT組裝結果在校正前后有明顯的差異。
圖1 ?組裝結果堿基準確性比較
用BUSCO對各版本組裝結果進行完整性評估，采用的數據集為eudicotyledons_odb10 (2121 genes)。結果顯示：ONT+Illumina、PacBio以及stLFR+ONT三種方法的完整性無明顯差異，均達到92%以上。
圖2 組裝完成性評估
討論與結論
通過對比分析，Pacific Biosciences (Sequel I), Oxford Nanopore (PromethION) 和華大智造MGI stLFR三種長片段測序技術都能得到非常好的組裝效果。相對而言，華大智造stLFR技術所需投入量最低，僅為納克級別，并且組裝結果的mismatch和InDel最低，準確度最高，特別適用珍貴樣本或極端樣本檢測，同時測序成本上具有顯著優勢。
參考文獻：
Comparison of long read methods for sequencing and assembly of a plant genome.
doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992933
