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探索寡核苷酸雜質分離｜Shim-pack Scepter Claris液相色譜柱
探索寡核苷酸雜質分離
?Shim-pack Scepter Claris色譜柱
具有治療潛力的核酸和mRNA疫苗在制藥工業成為新的增長點。其中寡核苷酸發展迅猛，寡核苷酸是由20到60個堿基組成的單鏈或雙鏈核酸片段。包括反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾RNA （siRNA）、microRNA以及適配體。在生物化學、分子生物學和遺傳學中有著廣泛的應用。?
寡核苷酸由于細胞外穩定性低，溶劑被核酸酶解，同時難以進入細胞等因素的影響發展緩慢，近些年，由于核酸修飾（磷酸骨架，堿基以及糖環的修飾）以及遞送介質（脂質體等）等相關技術的突破，使其成為繼小分子藥物、抗體蛋白質藥物之后，出現的一類新模式藥物，是近年藥物開發的熱點之一。
寡核苷酸的結構決定了它極性非常強，在常規的反相色譜柱上很難保留，可以使用HILIC模式、離子交換模式或者借助于離了對試劑在反相柱上實現保留，不同分離模式各自有自己的局限性。IP-RP作為其中最常用的一種，應用范圍最廣，今天我們從方法開發的角度一探究竟。
Part 1
方法初篩
不同離子對試劑的選擇對于物質的保留差異較大。此次分析的樣品是20個堿基的寡核苷酸，優先選擇TEA作為離子對試劑，后期因為涉及進質譜進行質量確認，所以加入了100mmol的HFIP增加靈敏度。采用不同比例的有機相、結合不同濃度的緩沖鹽濃度，優化色譜方法，得到24張色譜圖，疊加如下文圖1所示。
整體色譜柱峰形優異，惰性化柱管對于因柱管導致的峰形拖尾等問題，改善明顯。
從②⑤⑧可以看出，隨著離子對試劑濃度的增加，保留提升，分離得到進一步的改善。
HFIP濃度以及有機相的比例會影響基線，200mmol/L的HFIP中有100%純乙腈流動相會引起基線的抬升，比如?, ?, ?和?的實驗結果。對比結果⑧和結果?，可以看出HFIP的提升，對于分離展現出不同的效果。此外，在一些文章中也提到需要在流動相中加入一定比例的HFIP，這樣使得TEA的溶解度變小， 因而TEA更容易綁縛在固定相上形成更穩定的離子對試劑層 。這促使離子相互作用的分離機制非常顯著，尤其針對于硫代寡核苷酸。
從②③的實驗結果可以看出，不同的有機試劑含量對于雜質分離展現不同的選擇性。不同流動相HFIP和TEA中的濃度、以及有機溶劑乙腈與甲醇的混合比例對FLP和FLP相關雜質分離影響較大。
最終，通過矩陣設計，考察分離效果，結果表明實驗條件⑤的分離效果最佳，采用的流動相條件為:100mM HFIP 10mM TEA/ACN 50%_MeOH 50%。
Part 2
方法優化
文獻中提到升高的柱溫通常減小峰寬，從而一定程度上改善了雜質分離，因此也是主要的一個影響因素。Scepter Claris C18色譜柱采用雜化硅膠，不僅具有雜化硅膠可以耐受高柱溫的特性，而且Scepter Claris色譜柱采用生物惰性涂層，相比于其他柱管的惰性化程度，惰性更優，峰形改善更明顯。所以，進一步優化如圖3所示，柱溫65℃的峰展寬更弱，峰形更窄。
完整實驗結果請查看“島津實驗器材”微信公眾號
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采用島津Nexera XS inert 系統，配套島津全新卓越惰性雜化硅膠色譜柱——Shim-pack Scepter Claris C18，從流動相比例、梯度、柱溫等方面優化方法，避免了不銹鋼柱管吸附導致的峰形問題，有效實現寡核苷酸的分離分析。結合LabSolutions MD可實現整個工作流程優化自動化，包括生成分析進度表、如自動峰值跟蹤具體的數據處理功能、色譜的評價值和設計空間等，有效提升方法開發的效率。
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