捕獲早期RNA轉錄動力學的關鍵
生命的活動是通過蛋白質的制造而發生的，蛋白質賦予我們的細胞結構和功能。細胞蛋白質從DNA編碼的基因指令中獲得行進順序，他們的序列首先被復制并在一個叫做轉錄的多步驟過程中被制造成RNA。
科羅拉多州立大學的一個研究合作項目專門研究高分辨率熒光顯微鏡和計算模型，以實時、精細地可視化和描述這類生命過程，在單基因水平上。現在，由博士后研究員Linda Forero-Quintero領導的科學家們首次通過記錄RNA聚合酶在何處、何時以及如何通過與DNA序列結合啟動轉錄來觀察早期RNA轉錄動力學。
這項突破性技術，詳見《Nature Communications》雜志，有無數可能的拓展：包括加深對基本生物學過程的理解，揭示某些疾病的遺傳基礎。
“這是第一次有人研究單拷貝基因中的RNA聚合酶磷酸化動力學，”Forero說，他是蒙福特生物化學教授Tim Stasevich和副教授Brian Munsky的聯合培養博士后研究員。“在過去，這種早期的轉錄活動只能通過基因陣列來觀察，這是由數百個基因拷貝組成的人工結構，在細胞核中并不常見。”
Stasevich和Munsky領導了一項由W.M.Keck基金會和國家普通醫學科學研究所資助的合作，旨在揭示和量化活的單細胞中的實時基因表達。在這兩個實驗室工作的Forero在合作的贊助下，以前研究過與神經疾病相關的細胞膜中的蛋白質和轉運體。
早期轉錄活性
如《Nature Communications》中所述，Forero等人設計了一種方法，使用已建立的哺乳動物細胞系、工程熒光抗體片段和定制的超分辨率顯微鏡，以生動的顏色（藍色、綠色和紅色）捕捉早期轉錄過程。更具體地說，他們觀察到當RNA聚合酶II（RNAP2）轉錄酶被磷酸化或被磷酸基團修飾時，轉錄周期的開始，Munsky說：“這里的跨學科科學是新的實驗能力和單細胞動力學的機械計算模型的奇妙結合，兩者在各自領域都非常新穎。”在實驗室里，研究人員將他們的抗體片段加載到一個已建立的哺乳動物細胞系中，該細胞系含有一個報告基因，當被轉錄時，會被一個熒光標記的蛋白質點亮。Stasevich在幾年前幫助開發的抗體片段，用熒光分子標記，照亮RNAP2尾部的特定靶點。將這些標記技術結合起來，研究人員可以區分轉錄周期中的三個不同步驟，并用不同的顏色標記。用該系統獲得的圖像轉化為熒光強度波動。然后，研究人員利用這些信號來解釋RNAP2磷酸化在整個轉錄周期中在單個拷貝基因上的時空組織將其轉化為基于隨機微分方程的計算模型。通過擬合這個統計模型來重現所有的實驗結果，計算團隊隨后擴展了他們的分析，以收集有關不同分子及其轉錄過程中狀態的新的機械和定量信息。
例如，他們估計了有多少單個RNA聚合酶分子聚集在DNA啟動子區域形成短暫的簇，這些簇持續多久，以及聚合酶如何、何時、何地沿著DNA分布。例如，他們發現，每一次轉錄活動都會在基因的啟動子區域產生一個由5到40個RNA聚合酶組成的簇，其中46%最終成功地轉錄了RNA。他們還發現，每一個RNA在釋放前大約需要5分鐘才能被完全轉錄和處理。
Forero說，這項技術具有深遠的潛力，特別是與諸如CRISPR這樣的新技術相結合，在這種技術中，特定的基因可以被挑選出來并加以操縱。選擇某個感興趣的基因，比如說與疾病有關的基因，并應用CSU研究人員對轉錄周期的實時讀數，可以讓研究人員在單個基因的活動水平上觀察疾病過程，在一個基因中，基因是這項工作最令人興奮的方面。
