寄生蟲標本的保存實驗——濃集法
實驗材料 | |
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試劑、試劑盒 | |
儀器、耗材 | |
實驗步驟 | 一、原蟲包囊和蟲卵的保存 汞碘醛液10 ml與糞便1 g混勻后密封在瓶內,可保存其中的原蟲包囊及蟲卵數月之久,也可在經濃集法處理的糞便沉渣中加等量或1倍量的10 %甲醛液(加熱至70 ℃),搖勻,用石蠟封固瓶口。 二、蠕蟲成蟲的保存 1. ?線蟲 ? 2.吸蟲 固定一般用10 %甲醛,24小時后移至5 %甲醛中保存;或用70 %酒精固定0.5~3小時,視蟲體大小而定,再移至新的70 %酒精中保存。 3.絳蟲 三、昆蟲的保存 1. ?干標本保存系保存有翅昆蟲成蟲。
圖1 有翅昆蟲針插法 2. ?濕標本保存用于保存有翅昆蟲的卵和幼蟲期及無翅昆蟲和蜱螨類的發育各期。 所有保存標本須詳細記錄標本名稱、宿主、采集地點、采集日期及采集者姓名。 樟腦混合劑配制:樟腦粉6份,氯仿1份,木餾油1份,石蠟油4份。先將樟腦粉1.5份與氯仿1份混合,隨后加樟腦1.5份與木餾油1份,用玻璃棒混勻,最后加樟腦粉3份及石蠟油4份,再攪勻備用。此混合劑易燃,宜置于嚴密而不透氣的瓶內儲藏。 常用固定液配制: ⑴酒精:通常用70 %或75 %酒精為固定液。用商品供應95 %酒精作稀釋配制。取95 %酒精加至需要稀釋的濃度,再加蒸餾水到95 ml即可;或者,可按下列稀釋。 所需酒精濃度/原酒精濃度×配成酒精量=所需原酒精量(ml) ? 配成酒精量-所需原酒精量=應加蒸餾水量(ml) ⑵福爾馬林(37 %~40 %的甲醛水溶液) ⑶布氏(Bless)液:福爾馬林原液7 ml,酒精(70 %)90 ml,冰醋酸(臨用前加入)3~5 ml混合配成。 四、原蟲低溫保存 用液氮保存原蟲,具有保持原蟲生物學特性,且保存時間較長的優點。現僅介紹瘧原蟲、弓形蟲、人毛滴蟲及陰道毛滴蟲的低溫保存方法。 1. ?凍存方法 惡性瘧原蟲:將從受染者采得的抗凝含蟲血或體外培養的培養物,經1500 rpm離心10分鐘,加入與沉積細胞等量的24%二甲基亞砜(DMSO)生理鹽水溶液(0.9 %生理鹽水或5 %葡萄糖生理鹽水76 ml中加入DMSO 24 ml)保護劑,充分混勻后在室溫中放置30分鐘,按0.5~1.0 ml分裝入無菌安瓿(或塑料管)內,封口(或蓋嚴)后將之放入標明批號的紗布袋中,裝于液氮罐的提筒內,先置于液氮罐的頸部,該處約為-70 ℃,30分鐘后,置液氮中(-196 ℃)凍存。 鼠瘧原蟲:從感染瘧原蟲第3~4天的小鼠心臟取血(或摘除眼球取血),注入試管,肝素抗凝,加入等量的10 %或15 %DMSO及15 %或20 %小牛血清為保護劑;或加入等體積的甘油、山梨醇保護液(4.2 %山梨醇生理鹽水180 ml加純甘油70 ml),充分混勻。按照上法裝管及凍存。也可以在1 mm3陽性鼠血加0.1 mm3的3.8 %枸櫞酸鈉抗凝之后就裝于液氮罐提筒中,立即直接置液氮中保存,2年內多數原蟲仍有活力。 弓形蟲:用無菌注射器吸取10 %DMSO 2 ml,注入感染4天的小鼠腹腔,抽洗2次,抽出液混勻后即注入無菌塑料管內(0.5~1 ml/管),凍存法同上。 陰道毛滴蟲:用無菌拭子取陰道分泌物,放入培養基中培養48小時,轉種于RPMI-1640培基中2天。取含蟲培養液經1000 rpm/min離心10分鐘,在沉淀中加入10 %DMSO 2 ml,同上法分裝及凍存。 人毛滴蟲:取腹瀉患者的含蟲糞便培養于洛氏培養基中48小時,轉種于洛氏培養基或RPMI-1640培養基中培養2天后計算蟲數(達7×105)。加等量10 %DMSO并加Tween-20于DMSO中。裝管同上法。但凍存過程應先將小管置于-10 ℃中15分鐘,移到液氮罐頸2分鐘,再置入液氮中凍存。 上述所用的保護劑(液)均應經高壓滅菌,保存于4 ℃冰箱。RPMI-1640配制50 %DMSO,用時再稀釋所需濃度,加15 %或20 %小牛血清,調pH至7.2。 2. ?復蘇與觀察 |