抗生素檢定用芽孢懸液的制備及注意事項

管碟法是國內外常用的抗生素微生物檢定法，利用管碟法測定抗生素效價，具有準確、直觀、重復性好等優點，因而被廣泛采用。但是整個試驗過程中影響結果的因素很多，任何一個環節操作不當或者忽略就會造成很大誤差，導致整組試驗失敗。其中，芽孢懸液的制備就有很多需要注意的地方。

在用管碟法檢定抗生素時，需要將菌懸液與培養基混合均勻、覆蓋在底層培養基上，以形成抑菌圈。其中，對于菌懸液的制備要求為：

將所用菌的斜面培養物用 1～2 ml 滅菌水洗下，形成菌懸液；將菌懸液在營養瓊脂平皿上均勻涂布，置于 35～37℃ 條件下培養 7 天；涂片、染色，鏡檢芽孢率 ≥ 85% 時，用 10 ml 滅菌水將芽孢和菌體的混合物洗下，制成懸液；65℃ 水浴加熱 30 min，殺死菌體，形成有活性的芽孢懸液；冷卻、冰箱中保存備用。

根據實際操作中的經驗，對這一環節需要注意的事項總結如下：

1 應該嚴格按照標準操作，將涂好的平皿連續培養 7 天再洗脫芽孢，這樣也有助于芽孢懸液的均一性，避免由于操作標準不一造成的試驗結果的偏差。有文章報道，將平板培養至 2、3、4、5、6 天與培養至第七天，制成的懸液在抗生素效價測定中無差異；但本人在實際試驗中發現，培養 3 天的短小芽孢菌，鏡檢時芽孢率<80%, 并且平皿一旦從培養箱中拿出來，室溫放置至第 10 天，芽孢率也不會再發生明顯變化，這顯然不符合《中國獸藥典》規定的芽孢率 ≥ 85% 的要求。

2 試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時應保持菌種及菌液的新鮮。一般菌種一月轉種一次，冰箱冷藏保存。對易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進行單菌分離；其他菌株可半年分離一次。

3 試驗菌傳代不超過 5 次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養物用滅菌水洗下后，應在 65℃ 加熱 30 分鐘，使菌體的菌齡一致（有資料顯示可 70～75℃ 水浴 30 min 殺死菌體）。

4 加入菌懸液的體積，一般不少于 0.3 ml，并且不大于上層培養基體積的 1%（有資料說不大于 2%）。如果加入菌懸液的體積過小，則在同次實驗中，不同次加入菌懸液的體積相差較大， 造成實驗誤差；如果加入菌懸液的體積過大，則會使上層培養基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養基中可能造成培養基結塊，影響測定結果。對于加入菌懸液體積的控制，可通過調節菌懸液的濃度來實現。