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核酸提取基因組DNA的提取

2019.8.02

?? DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學研究的主要對象,因此DNA的提取也應是分子生物學實驗技術中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本談不上進行分子生物學方面的實驗。在DNA提取過程中應做到1,根據不同研究需要，保證結構的相應完整性；2,盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質、多糖及RNA等)；3,保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。下面結合不同的研究對象列出幾種相應的DNA提取方法。

??? 方法1，基因組總DNA的大量提取

??? 本方法通過液氮研磨粉碎動植物組織、裂解液裂解細胞、有機溶劑抽提，使進入水相的核酸與蛋白成分分開，在RNA酶作用下，降解RNA，得純度較高的DNA樣品。

??? 一：儀器? 高速冷凍離心機、臺式離心機、恒溫水浴、低溫冰箱或冰柜、冷凍真空干燥器、取液器、電泳儀、水平電泳槽、紫外觀測儀

??? 二：試劑細胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；飽和酚；氯仿/異戊醇；異丙醇；70%及無水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE緩沖液；載樣緩沖液

??? 三:操作動植物材料10g(鮮組織) 0.5g(干凍組織)
??????????????????????????? 液氮,研碎
10ml裂解液(含1/10體積酚),(65℃預熱),?
??????????????????????????? 加入等體積氯仿, 65℃放置30分鐘，
間隔5－10min輕搖一次,?
離心(12000-15000rpm, 15min )
?????????????????? 上清液
靜止下
0.6體積冷異丙醇,
0.1體積3MpH5,2乙酸鈉,?
???????????????? 挑取絮狀體, 70%冷乙醇洗滌,真空干燥,
??????? 2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃,10-30分復溶和除RNA
????????????????????????
等體積酚/氯仿,氯仿抽提
（輕輕混勻、冰浴沉淀5min，5000RPM離心5min，取上清）
上清液
2V無水乙醇、1/10VnaAC,
-20,2或-80℃，30min
???????????????????????????????? 10000RPM,10min
沉淀?
70%冷乙醇洗滌
真空干燥

干粉-20℃保存，
或復溶于0.5-1mlTE或水中,分裝成小體積, -20℃或4℃保存
四：鑒定?
所提DNA進行Agarose膠分析（電泳過程見附），紫外觀測儀觀測，凝膠成像系統拍攝。
注意:
1,裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解
2，酚一定要堿平衡
????? 3,各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解
????? 4,取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾.
????? 5,異丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。
????? 6,本方法適用于以DNA片段的酶切分析、Southern印跡等中，具有快速、省時、省線的特點。
????? 7,此方法也適合菌類基因組DNA的大量提取。