實驗室分析方法的驗證原來如此重要

? 任何分析測試的目的都是為了獲得穩定、可靠和準確的數據，分析方法驗證也在其中起著極為重要的作用。方法驗證的結果可以用于判斷分析結果的質量、可靠性和一致性。這是所有分析質量管理體系不可分割的一部分，許多法規和質量管理標準也要求是暗示進行分析方法的驗證。

　　何時進行方法驗證

　　在下列情況下，要求對分析方法進行驗證、證實或重新驗證：

　　1.首次用于常規檢測前;

　　2.轉到另一個實驗室時;

　　3.采用《藥典》及其它法定標準未收載的檢驗方法;

　　4.法規規定的其他需要驗證的檢驗方法。

　　分析測量的目的是產生準確可靠的數據。只有方法驗證是無法保證這一目標的實現，但是應當將其作為分析測量質量保證體系的一部分。

　　圖1揭示了影響數據質量的不同因素

　　儀器確認意味著儀器有確定的技術指標、經過檢測并證實其適用于需要驗證的方法。接著，在經過確認的儀器上驗證分析方法，證明其按預期要求運行。這個過程不依賴于任何特定的儀器。如果我們希望方法能在不同廠家的儀器上使用，也應使用那些儀器進行方法驗證。

　　法規和質量管理標準要求

　　對分析實驗室有影響的法規和質量管理標準都要求進行分析方法驗證。有的法規中直接使用“驗證”一詞，并列出特定參數，也有的法規用這樣的陳述暗示驗證要求——“檢測方法應適合于預期用途。”驗證要求指南出自各類不同的機構，但驗證目的都是為了獲得有效的分析檢測結果。這對于通過分析檢測來確保產品質量和安全而言是非常重要的。

　　圖2. ICH、USP和ISO 17025中的方法驗證參數。

　　驗證內容八項

　　準確度、精密度(包括重復性、中間精密度和重現性)、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。

　　一、準確度： 是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般以百分回收率表示。至少用9次測定結果進行評價。

　　二、精密度： 是指在規定的條件下，同一個均勻樣品，經過多次取樣測定所得結果之間的接近程度。用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

　　1、重復性：相同條件下，一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性。至少9次。

　　2、中間精密度： 一個實驗室，不同時間不同分析人員用不同設備測定結果的精密度。

　　3、重現性：不同實驗室，不同分析人員測定結果的精密度。分析方法被法定標準采用應進行重現性試驗。

　　三、專屬性：指在其他成分可能存在的情況下，采用的方法能準確測定出被測物的特性，用于復雜樣品分析時相互干擾的程度。鑒別反應、雜質檢查、含量測定方法，圴應考察專屬性。

　　四、檢測限：指試樣中被測物能被檢測出的最低量，無須定量。用百分數、ppm或ppb表示。

　　五、定量限：指樣品中被測物能被定量測定的最低量，測定結果應具一定的精密度和準確度。

　　六、線性：系指在設計的范圍內，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度。

　　七、范圍：能達到一定的精密度、準確度和線性的條件下，測試方法適用的高低限濃度或量的區間。

　　八、耐用性：指在一定的測定條件稍有變動時，測定結果不受影響的承受程度。

　　方法驗證的具體內容

　　(一)準確度

　　準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。準確度應在規定的范圍內測試。用于定量測定的分析方法均需做準確度驗證。

　　1.測定方法的準確度

　　可用已知純度的對照品做加樣回收測定，即于已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含被測成分量之差，除以加入對照品量計算回收率。

　　在加樣回收試驗中，應注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標準曲線線性范圍之內;應注意加入對照品的時間(供試品預處理前);對照品的加入量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。

　　2.數據要求

　　在規定范圍內，取同一濃度的供試品，用6個測定結果進行評價;或設計3個不同濃度，每個濃度分別制備3份供試品溶液進行測定，用9個測定結果進行評價，一般中間濃度加入量與所取供試品含量之比控制在1:1左右。應報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結果和回收率(%)計算值，以及回收率(%)的相對標準偏差(RSD%)或可信限。

　　(二) 精密度

　　精密度系指在規定的測試條件下，同一個均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

　　用于定量測定的分析方法均應考察方法的精密度。精密度包括重復性、中間精密度和重現性。

　　1.重復性 在相同操作條件下，由一個分析人員在較短的間隔時間內測定所得結果的精密度稱為重復性。

　　在規定范圍內，取同一濃度的供試品，用6個測定結果進行評價;或設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液進行測定，用9個測定結果進行評價。

　　2.中間精密度

　　在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度，稱為中間精密度。 為考察隨機變動因素對精密度的影響，應進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設備等。

　　3.重現性

　　在不同實驗室由不同分析人員測定結果之間的精密度，稱為重現性。

　　當分析方法將被法定標準采用時，應進行重現性試驗。例如，建立獸藥典分析方法時應通過不同實驗室的復核檢驗得出重現性結果，復核檢驗的目的、過程、重現性結果均應記載在起草說明中。應注意重現性試驗用的樣品本身的質量均勻性和貯存運輸中的環境影響因素，以免影響重現性結果。

　　4.數據要求 均應報告標準偏差、相對標準偏差或可信限。

　　(三)專屬性

　　1.意義與要求

　　專屬性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正確測定出藥材、飲片、藥材提取物或制劑中被測成分的特性。鑒別、限量檢查、含量測定等方法均應考察其專屬性。如方法不夠專屬，應采用其他方法予以補充。

　　2.鑒別試驗

　　鑒別應能與可能共存的物質或結構相似化合物區分。不含被測成分的供試品，以及結構相似或組分中的有關化合物，均不得干擾測定。顯微鑒別、色譜及光譜鑒別等應附相應的代表性圖像或圖譜。

　　3.含量測定和限量檢查

　　以不含被測成分的供試品(除去含待測成分藥材或不含待測成分的模擬復方)試驗說明方法的專屬性。色譜法和其他分析方法，應附代表性圖譜，并標明主成分在圖中的位置，以空白對照(除去含待測成分藥材或不含待測成分的模擬復方)試驗說明方法的專屬性。色譜法中的分離度應符合要求，必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測，對色譜峰進行定性檢查。

　　(四)檢測限

　　檢測限系指供試品中被測物能被檢測出的最低量。確定檢測限常用的方法如下。

　　1.直觀法

　　用一系列已知濃度的供試品進行分析，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。 可用于非儀器分析方法，也可用于儀器分析方法。

　　2.信噪比法

　　僅適用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度供試品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3∶1或2∶1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

　　3.數據要求應附測試圖譜，

　　說明測試過程和檢測限結果。

　　(五)定量限

　　定量限系指供試品中被測成分能被定量測定的最低量，其測定結果應具一定準確度和精密度。用于限量檢查的定量測定的分析方法均應確定定量限。

　　常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比為10∶1時相應的濃度或注入儀器的量進行確定。

　　(六)線性

　　線性系指在設計的范圍內，測試結果與供試品中被測物濃度直接呈正比關系的程度。

　　應在規定的范圍內測定線性關系。可用一貯備液經精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試品的方法進行測定，至少制備5個濃度的供試品。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經數學轉換，再進行線性回歸計算。

　　數據要求：應列出回歸方程、相關系數和線性圖。

　　(七)范圍

　　范圍系指能達到一定精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區間。 范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其范圍應大于被限定含量的區間。溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍應為限度的±20%。

　　(八)耐用性

　　耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為使方法用于常規檢驗提供依據。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明。典型的變動因素有：被測溶液的穩定性，樣品提取次數、時間等。液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成比例或pH值，不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱，柱溫，流速及檢測波長等。氣相色譜法變動因素有：不同廠牌或批號的色譜柱、固定相，不同類型的擔體，柱溫，進樣口和檢測器溫度等。薄層色譜的變動因素有：不同廠牌的薄層板，點樣方式及薄層展開時溫度及相對濕度的變化等。經試驗，應說明小的變動能否通過設計的系統適用性試驗，以確保方法有效。

　　(九)系統適用性試驗

　　對一些儀器分析方法，在進行方法驗證時，有必要將分析設備、電子儀器與實驗操作、測試樣品等一起當作完整的系統進行評估。系統適用性便是對整個系統進行評估的指標。系統適用性試驗參數的設置需根據被驗證方法類型而定。

　　色譜方法對分析設備、電子儀器的依賴程度較高，因此所有色譜方法均應進行該指標驗證，并將系統適用性作為分析方法的組成部分。具體驗證參數和方法參考《中國獸藥典》有關規定。

　　方法再驗證

　　在某些情況下，如原藥提取工藝改變、制劑處方或工藝改變、分析方法改變等，均有必要對分析方法再次進行全面或部分指標的驗證，以保證分析方法可靠，這一過程稱為方法再驗證。再驗證原則：根據改變的程度進行相應的再驗證。

　　當原藥提取工藝或制劑工藝發生改變時，含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明含量測定方法中發生的成分變化對主成份的測定無干擾。

　　當制劑的處方組成改變、輔料變更時，可能會影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測定的準確度，因此需要進行輔料對鑒別、對含量測定影響的方法再驗證。

　　當質量標準中某一項目分析方法發生改變時，如采用高效液相色譜法測定含量時，檢測波長發生改變，則需要重新提供檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等相應的方法學研究資料，證明修訂后分析方法的合理性、可行性。

　　驗證報告和其他文件

　　一旦方法開發并經過驗證，即應形成驗證報告。報告應包含足夠的信息以使經驗豐富的分析人員能夠重復驗證研究。驗證報告通常應包含以下內容： 方法的目的和范圍(適用性、類型)、方法簡述、職責、 化合物類型和基質、 所有化學品、試劑、參考標準、QC樣品及其純度、級別、來源或制備的詳細要求、 標準物質和化學品的質量檢查程序安全預防措施、 從方法開發實驗室轉到常規分析的方法實施計劃和程序從耐用性試驗得到的重要參數、 如何進行實驗的詳細參數和條件，包括樣品制備和方法參數統計程序和代表性計算公式 常規分析中的QC過程，如系統適用性試驗 代表性圖表，如色譜圖、光譜圖和包含原始數據的校正曲線方法的接受限度和性能數據預期的測量不確定度結果重新驗證的判斷準則 方法開發和驗證人員的資質記錄。

　　小結

　　在規范化或質量管理標準環境下運行的實驗室推薦采用正式方法，諸如ISO或藥典規定方法。例如，美國食品藥品和化妝品法案要求FDA監管行業使用法定方法或證明其等效性。ISO/IEC 17025要求：“應優先使用以國際、區域或國家標準發布的方法。”這些方法已經得到驗證，因此，許多分析人員錯誤地認為這類方法不需要在實驗室中做任何進一步的驗證、證實或試驗即可投入使用。要知道，所有檢測方法的適用性應在實際應用條件下得到證實。ISO/IEC 17025在5.4.2中有類似的要求：“在引入檢測或校準之前，實驗室應證實能夠正確地運用這些標準方法。如果標準方法發生了變化，應重新進行證實。