核纖層和富含核纖層組分的制備實驗——爪蟾卵母細胞

NaClKClMgSO4Ca（NO3）2CaCl2NaHCO3苯青霉素硫酸鏈霉素Na-HEPES

培養皿

卵母細胞收集和制備

1. 從成熟的雌性非洲爪蟾取整個或部分卵巢，在含 88 mmol/L NaCl，1 mmol/L KCl，0.9 mmol/L MgSO₄，0.33 mmol/L Ca（NO₃）₂，0.41 mmol/L? CaCl₂，2.4 mmol/L NaHCO₃，10 μg/ml 苯青霉素，10 μg/ml 硫酸鏈霉素和 10 mmol/L Na-HEPES，pH 7.6 的溶液中 18℃ 保存 2 到 4 小時。

2. 作好準備后，將卵巢組織移至一含少量溶液 L 的硅化過的培養皿中。

溶液 L：

83 mmol/L KCl

17 mmol/L NaCl

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2

細胞核和核膜的手工分離

3. 在溶液 L 中用 5^#?修表鑷子挑取黑色半球和白色半球之間的過渡帶中的單個卵黃卵母細胞。

4. 再用另一把 5^#?鑷子夾住皺褶，兩把鑷子向相反方向用力將卵母細胞撕開。

5. 用鑷子將細胞核從卵漿質中分出來，在溶液 L 中用一口徑 0.7~0.8 mmol/L 的吸頭反復吹吸 3 到 6 次清洗細胞核。

6. 最后再用新鮮的溶液 L 清洗一次細胞核并轉移至一含有溶液 M 的硅化過的試管中。

溶液 M：

83 mmol/L KCl

17 mmol/L NaCl

10 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2

7. 用一 0.3~0.4 mm 口徑的吸頭吹打細胞核。

8. 將沒有核質的核被膜物質轉移至一硅化的試管中，用溶液 L 反復吹打清洗，然后用盡量少體積的溶液 L 將其移至一 1.5 mI 的 Eppendorf 管中。

9. 匯合從 20~100 個細胞核中收集核被膜后在 8000 g 離心 4 分鐘進行收集。

用 Triton X-100 和 1 mol/L KCl 抽提清洗過的核被膜

10. 為了制備富含爪蟾卵母細胞核纖層和核膜孔復合物的組分，將來自 50 個細胞核的核被膜用 300 μl 的 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1 mol/L KCl 和 1% Triton X-100 溶液重懸浮；室溫孵育 20 分鐘；然后在 8000 g 離心 4 分鐘收集鹽和非離子活化劑抽提的核被膜。

11. 棄去上清，用 300 μl 的 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4）溶液重懸沉淀，再次在 8000 g 離心 4 分鐘以清洗沉淀。用 10 mmol/L Tris-HCl 重懸浮清洗過的核膜孔復合物-核纖層組分。