測序簡史（二）
（3）原因不明的復雜結構，測序結果出現突然信號減弱或消失
從序列上看，DNA堿基排列并無特別異常。估計是DNA整體出現復雜結構，從某一位置開始聚合酶的聚合反應便無法進行。
圖4 復雜結構引起的信號中斷??
2.出現套峰是什么原因？
在測序反應中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，歸結其形成原因有以下幾點：
（1）測序引物在模板上有兩個結合位點(圖5)；
（2）模板不純，如果是質粒或是菌液，原因是非單克隆(圖6)，如果是PCR,原因為非特異性條帶(圖7)；
（3）模板序列的特殊結構，如poly結構、發卡結構等(圖8)；
（4）引物降解，或引物不純(圖9，圖10)。
圖5 雙引物結合位點引起的套峰??
圖6 由于質粒或菌液為非單克隆引起的套峰
圖7 PCR為非特異性條帶引起的套峰??
圖8 模板特殊結構引起的套峰
圖9 引物輕微降解或引物不純引起的套峰
圖10 引物嚴重降解或引物不純引起的套峰
四、解決方案匯總
1.樣品測序無信號
可能是引物結合位點不存在或被破壞；建議更換引物測序或重新提供樣品測序。
2.樣品測序信號差
可能是引物或模板的質量不高或是引物和模板的匹配性不好引起的，也可能是樣品濃度偏低；建議提供高質量樣品測序。
3.樣品測序衰減
可能是由于特殊結構如Poly結構、重復序列、回文結構、發卡結構、GCrich、AT富集等導至的測序衰減，由于是樣品本身結構問題無法優化建議反向測序進行拼接以得到完整序列，還有一種衰減的情況就是在一段正常峰型后逐漸衰減，可能是模板量反應量不足導至，建議制備高濃度模板測序。
4.樣品測序套峰
套峰細分的話有如下幾種情形:
①全雙峰：多引物結合位點（針對菌液、質粒樣品），非特異性擴增（針對PCR產物）；
②前雙峰：多引物結合位點，其中一套模板測序中斷（針對菌液、質粒樣品），多引物結合位點（PCR未純化樣品），引物二聚體或小片段干擾（針對PCR已純化樣品）；
③中間雙峰：非單克隆（針對質粒、菌液樣品），堿基缺失或等位基因雙模板（針對PCR未純化樣品）；
④后雙峰：非單克隆（針對菌液、質粒樣品），堿基缺失（針對PCR樣品）；
針對二聚體及小片段干擾的情況建議電泳切膠回收純化；針對多引物結合位點的情況建議更換引物測序或反方向測通樣品；針對堿基缺失建議克隆測序；針對非單克隆建議在克隆無誤的前提下重新挑取單克隆測序；針對非特異性擴增建議優化反應條件重新制備樣品測序；針對等位基因雙模板建議克隆測序。
5.樣品測序中斷
可能樣品存在特殊高級結構，導至dNTP和ddNTP在某一堿基位點后無法與模板結合，測序酶無法繼續延伸，建議使用反向引物進行測序經拼接后可以得到完整序列；或酶切后亞克隆測序。
6.樣品測序移碼
測序從開端發生移碼可能是引物發生降解，建議重新提供引物；測序局部出現移碼，可能樣品存在特殊高級結構，建議反向測通。
7.樣品測序底峰干擾
可能測序引物不純，建議將引物進行PAGE膠純化后在進行測序或重新提供引物測序；可能測序樣品不純，混有正、反向引物，建議重新制備樣品測序。
? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???第二代測序技術
一、簡介
小編上大學的時候，二代測序技術主要有三家公司，羅氏的454技術，illumina的Hiseq和Solexa技術還有ABI的Solid技術。不管是哪家公司，其具體原理如何，暫且不說。他們都是邊合成邊測序，也就是說通過在序列合成的同時通過各種標記進行實時的序列識別。接下來，小編還沒有畢業，羅氏和ABI的測序技術就提前畢業了。只剩下一家illumina。熟悉二代測序的，都清楚，他家是雙端測序，通量高。Illumina基本上每天推出一款新的產品。并且通量越來越大，成本越來越低。說最近今年的例子，14,15年推出的Hiseq 4000 15,16年推出的X ten（10臺hiseq X）國內有很多公司引進了這套設備。北京諾禾致源，藥明康德等。目前國內的二代測序通量基本上滿足了國內的科研需要和臨床應用需求。由于先動優勢，其他的測序公司也就放棄了在Xten市場上與諾禾進行角逐，轉而成為諾禾測序市場上渠道客戶。這樣看來華小之間，相愛相殺。17年南京諾禾（背后有資本的力量，目前市場上的好多做健康管理，基因檢測的都將從這里走渠道。），其實就是委托諾禾進行運營和管理，畢竟人家經驗豐富。引入25臺Novaseq測序儀。這些測序儀將主要用于生命科學健康方向。可以預見的將來，諾禾將成為二代測序市場的占用者，有一句話說的好，諾禾測序儀抖一抖，好幾百家公司的數據都不合格。
由于二代測序需要對熒光信號進行識別，但是由于熒光信號較弱，因此需要進行擴增建庫。也就是這一步導至二代測序存在偏好性。
二、主要應用方向
二代測序目前是科研市場上的主力，廣泛的使用在物種基因組測序，轉錄組測序，群體測序上。另外這兩年也在尋求醫學上的發展，隨著成本的降低，其在醫學市場上的應用將會越來越多。
三、二代測序相關的名詞解釋
什么是高通量測序？
高通量測序技術（High-throughputsequencing，HTS）是對傳統Sanger測序（稱為一代測序技術）革命性的改變, 一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定, 因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。
什么是基因組重測序（Genome Re-sequencing）
全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區域擴大到全基因組范圍。通過構建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結合的策略進行高通量測序，實現在全基因組水平上檢測疾病關聯的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結構變異等，具有重大的科研和產業價值。
什么是de novo測序
de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑。隨著新一代測序技術的飛速發展，基因組測序所需的成本和時間較傳統技術都大大降低，大規模基因組測序漸入佳境，基因組學研究也迎來新的發展契機和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測序技術以及強大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地測定并分析所有生物的基因組序列。
什么是外顯子測序（whole exon sequencing）
外顯子組測序是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優勢，但無法研究基因組結構變異如染色體斷裂重組等。
什么是mRNA測序 （RNA-seq）
轉錄組學（transcriptomics）是在基因組學后新興的一門學科，即研究特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型與拷貝數。Illumina提供的mRNA測序技術可在整個mRNA領域進行各種相關研究和新的發現。mRNA測序不對引物或探針進行設計，可自由提供關于轉錄的客觀和權威信息。研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表達、cSNP、全新的轉錄、全新異構體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉錄等最全面的轉錄組信息。簡單的樣品制備和數據分析軟件支持在所有物種中的mRNA測序研究。
什么是small RNA測序
SmallRNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠對細胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭后體外反轉錄做成cDNA再做進一步處理后，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學應用。
-
科技前沿
