肝素的生產方法
方法一、酶解-樹脂法酶解 取100kg新鮮腸黏膜(總固體5%-7%),加苯酚200ml (0.2%),如氣溫低時可不加。在攪拌下加入絞碎胰0.5-1kg(0.5%-1%),用 300-400g/L(30%-40%)NaOH溶液調節pH8.5-9,升溫至40-45℃,保溫2-3h。pH8,再加5kg粗食鹽(5%)升溫至90℃左右,用6mol/L HCl調節pH 6.5左右,停止攪拌,保溫20min,以布袋過濾,得酶解濾液。腸黏膜[胰漿,NaOH]→[pH8.5-9, 40-45℃, 保溫2-3h]腸黏膜液[NaCl, 6mol/L HCl]→[pH8; 90℃, pH6.5]濾液吸附、洗滌、洗脫 取上述濾液冷至50℃以下,用6mol/L NaOH調節pH7,加入5kgD-254強堿性陰離子交換樹脂,攪拌5h左右,交換完畢,棄去液體,用自來水漂洗樹脂至水清,用與樹脂等體積的2mol/L NaCl,攪拌洗滌15min,棄去洗滌液,再加2倍樹脂體積的1.2mol/L NaCl洗滌2次。用約樹脂體積一半的5mol/L NaCl洗脫1h,收集洗脫液,然后用約樹脂體積的1/3的3mol/L NaCl洗脫2次,合并洗脫液。濾液[D-254樹脂, NaOH]→[pH7, 5h]吸附[NaCl]→[2mol/L→1.2mol/L, →5mol/L, →3mol/L]洗脫液沉淀、脫水、干燥 將洗脫液用濾紙漿助濾,過濾1次,澄清濾液以體積計加入用活性炭處理過的0.9倍的95%乙醇,冷處沉淀8-12h。虹吸上清液棄去,按100kg黏膜加300ml的比例向沉淀中補加蒸餾水,再加入4倍量95%乙醇,冷處放置6h,收集沉淀,用無水乙醇脫水1次,丙酮脫水2次,置P2O5干燥器中真空干燥,得肝素鈉粗品。洗脫液 → 沉淀物[無水乙醇;丙酮]→[P2O5]肝素鈉粗品脫色、沉淀、干燥 用20g/L(2%)氯化鈉溶液配成100 g/L(10%)的肝素鈉溶液,以40g/L(4%)高錳酸鉀溶液進行氧化脫色,每億單位估計加入0.65mol高錳酸鉀。先將藥液調至pH8,預熱80℃,在攪拌下加入高錳酸鉀,保溫2.5h,以滑石粉作助濾劑,過濾,收集濾液。將濾液調節pH6.4,用0.9倍的95%乙醇置于冷處理沉淀6h以上,收集沉淀,溶于10 g/L(1%)氯化鈉溶液中,用量按肝素鈉粗品質量收率60%-70%計,配成50 g/L(5%)肝素鈉溶液,再用4倍量的95%乙醇冷處放置6h以上,收集沉淀物,用無水乙醇、丙酮脫水,乙醚洗滌1次,置P2O5干燥器中干燥,得肝素鈉精品。腸黏膜換算成總固體7%計,收率20000U/kg,最高效價141.6U/mg。肝素鈉粗品[20g/L NaCl]→肝素鈉溶液[KMnO4]→[pH8, 80℃, 2.5h]濾液 →[pH6.4, 6h]沉淀物[無水乙醇;丙酮;乙醚]→肝素鈉精品注射劑的制備 取肝素鈉成品溶于一定量注射用水中,封口,滅菌,即得。肝素鈉精品[注射用水]→注射劑
方法二、鹽解-樹脂法提取 取新鮮豬腸黏膜投入反應鍋中,按30g/L(3%)加入氯化鈉,NaOH調節pH9,逐步升溫至50-55℃,保溫2h,繼續升溫至95℃,維持10min,冷卻50℃以下,用30目雙層紗布過濾,收集濾液。豬腸黏膜[NaCl; NaOH]→[pH9; 50-55℃]濾液吸附、洗滌、洗脫、沉淀 取冷卻50℃以下的濾液,加入714型(強堿性)Cl-型樹脂(新樹脂用量為2%),攪拌8h后靜置過夜。次日虹吸除去上層液,收集樹脂,用水沖洗至洗液澄清,濾干,用2倍量1.4mol/L氯化鈉攪拌2h,濾干;再用1倍量1.4mol/L氯化鈉攪拌2h,濾干;繼續改用2倍樹脂量的3mol/L氯化鈉攪拌洗脫8h,濾干;再用1倍量3mol/L氯化鈉攪拌洗脫2h,濾干,合并濾液,加入等量95%乙醇沉淀,過夜,虹吸除去上清液,收集沉淀。丙酮脫水干燥,得粗品。濾液[714型樹脂]→吸附物[NaCl]→[1.4mol/L, 3mol/L]洗脫液[95%乙醇,丙酮]→粗品溶解、脫色、沉淀、干燥 粗品溶于15倍10 g/L(1%)氯化鈉溶液中,加入6mol/L鹽酸調pH1.5左右,過濾至清,隨即用5mol/L氫氧化鈉調節pH11,按3%加入過氧化氫(濃度為30%)25℃放置。開始不斷調整pH至11,第2天再按1%加入過氧化氫,調整pH11,繼續放置,共48h。過濾,用6mol/L鹽酸調節pH6.5,加入等量的95%乙醇沉淀。過夜。次日虹吸除去上清液,沉淀用丙酮洗滌脫水,干燥,即得肝素鈉精品。總收率20000U/kg腸黏膜(按腸黏膜的固體量為5%-7%計算)。粗品[1%NaCl, 6mol/L HCL]→[pH1.5]濾液[NaOH, H2O2]→[pH11, 25℃, 48h]濾液[6mol/L HCl, 95%乙醇]→[pH6.5, 24h]沉淀[丙酮]→肝素鈉精品
方法三、CTAB*提取法(*十六烷基三甲基溴化胺為長鏈季銨鹽)提取、絡合 按豬腸黏膜液(V):Na2SO4(m):硫酸鋁(m):CTAB(V)=1:0.15:0.04:0.001的配料比投料。取新鮮豬小腸黏膜投入反應罐中,攪拌下加入硫酸鈉,溶解后,用堿液調節pH11-11.5,升溫50℃,保溫攪拌2h,再加硫酸鋁,溶解后,用氫氧化鈉調節pH7.5-8,升溫至95℃,保溫10min,趁熱過濾,待濾液冷卻至60℃以下時,緩緩加入CTAB和硅藻土,攪拌吸附1h,靜置過夜,濾餅用40℃熱蒸餾水洗至無色,抽干即得絡合物。豬腸黏膜液[Na2SO4,堿液, Al2(SO4)3]→[pH11-11.5, 50℃, 2h; pH7.5-8, 95℃, 10min]提取液[CTAB, 硅藻土]→[60℃以下,1h]濾餅[蒸餾水]→ 絡合物解離、沉淀 取絡合物溶于適量氯化鈉溶液中,以冰醋酸調pH4,升溫60℃,保溫30min,靜置過濾? 。
