膠體金（金標）檢驗法
膠體金是一種常用的標記技術，有其獨特的優點。近年已在各種生物學研究中廣泛使用。免疫膠體金技術的基本原理是：氯金酸?(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。免疫金標記技術(Immunogold?labelling?techique)?主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紫色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中。
為什么霍亂可以用膠體金（金標）檢驗法進行快速篩查?？
霍亂弧菌快速檢測卡是利用單克隆抗體膠體金標記技術和膜層析技術研制而成，用于定性檢測樣本中可能存在的霍亂弧菌的特異性抗原?A及O139血清型?。首先按常規方法制備并篩選出效價高的抗O1群A抗原和抗O139抗原的單抗細胞株。然后采用枸緣酸鈉還原法制備膠體金顆粒，選擇玻璃纖維吸附最適濃度的金標抗體。按常規方法免疫家兔，制備霍亂弧菌的多克隆抗體。根據檢測對象（疑似病人糞便）的特殊性，研制了特異的稀釋液。一方面可裂解細菌，釋放抗原，提高檢測敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。 ?經二年多的反復試制，我公司完成的霍亂弧菌?O1群（O139）快速檢測試紙，其對霍亂弧菌最低敏感性10分鐘內106菌/ml陽性，達到臨床最低檢出量的要求，符合衛生部《霍亂防治手冊》要求，且對高濃度的菌液109?菌/ml無前置反應；用萃取液、正常人糞便標本及其它大腸中寄生菌進行的特異性鑒定表明，?該試紙條特異性為100%?
金特敏???霍亂快速檢測卡的特點是什么？
最低檢出量?：不低于?105cfu/ml適合臨床需要。?快速出結果?：稀釋直接裂解細菌，?10分鐘觀察結果滿足疾病控制要求。?便利使用?：獨立包裝，"插"式設計，操作簡捷，避免二次污染。?穩定性好?：無須冷藏，常溫保存?18個月。
質控線C線的意義是什么？
將羊抗鼠抗體包被于?NC膜，形成對照線C，同時在NC膜的一端固定膠體金標記的霍亂弧菌A抗原單隆抗體。檢測時，樣品依靠層析作用，沿著NC膜向前爬行。不論樣品中是否含霍亂弧菌，也就是說無論金標抗體是否結合霍亂弧菌抗原，都有一部分能與羊抗鼠抗體結合，形成紫色線的對照線C，即出現質控線C線，說明實驗是有效的。
為什么T線可作為檢測線？
采用雙抗體夾心法，在?NC膜包被羊抗鼠抗體同時，在另一側包被霍亂弧菌O1（O139）多抗，形成T檢測線。疑似霍亂病人的糞便樣品中若含有一定數量的霍亂弧菌，則與檢測端的金標抗體結合，向前爬行經過檢測線時，金標抗體－抗原復合物再與多抗結合，在局部沉積，出現紫色線，形成T檢測線，反之則不出現紫色T檢測線。?
為什么C、T兩條線都顯色才可判為陽性？
因為采用雙抗體夾心法，同時在?NC膜上包被了羊抗鼠抗體和霍亂弧菌O1多抗，被檢樣品中若含霍亂弧菌，在與標記在檢測卡檢測端的膠體金霍亂抗原結合后，沿NC膜爬行，與在T線形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—霍亂弧菌A（O139）抗原—霍亂弧菌O1多抗混合物，與C線形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—羊抗鼠抗體混合物，即出現兩條線才為陽性?。
只有C線，無T線說明了什么？
此結果判定為陰性，在檢測線?T線處，無膠體金免疫復合物形成，故不顯色；在質控C線處形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—羊抗鼠抗體混合物，說明膠體金標記正常，實驗結果有效。
C、T兩線都不顯色怎么辦？
若經重復檢驗后，?C、T兩線仍不顯色，說明膠體金標記失敗，檢測卡因受潮等原因失效。
為什么會出現假陽性？
目前按衛生部《霍亂防治手冊》要求，霍亂弧菌培養陽性才可認定為確診病例，假陽性是針對霍亂弧菌培養陽性結果（金標準）而言，根據臨床驗證應用以來的結果顯示，我們認為可能與以下三種情況有關：
*?根據本檢測卡的檢測原理，是檢測疑似病人糞便中的霍亂弧菌?O1?A抗原或O139抗原，與是否含有活菌無關，只要感染過霍亂弧菌，且達到一定的抗原量即可顯示檢測陽性，病人即使服藥后亦可檢出陽性。
*?在某省的臨床驗證中，曾出現?104/ml即可檢出的情況，高于衛生部《霍亂防治手冊》中106?-108/ml的檢出線。曾有一檢測卡陽性標本，經4次堿胨水增菌后，才培養出活菌。?
*?在經中國藥品生物制品檢定所的企業標準中，本檢測卡與副溶血弧菌、溶藻弧菌、麥氏弧菌、河弧菌、創傷弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、氣單胞菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌等?14種常見腸道細菌無交叉反應，除此外是否還有其他的交叉反應陽性細菌，我們正在探討。
假陰性會出現嗎？
任何診斷試劑都有一定的漏診率和誤診率，由于霍亂的特殊性，我們盡量提高檢出率，提高靈敏度、特異度，減少漏診（假陰性）。三個省級疾控中心?1680例臨床檢測的靈敏度是98.61%，特異度是100%。出現假陰性可能與樣品中的細菌含量低、或檢測卡失效等因素（受潮、膠體金標記失敗等）有關。?
為什么一定要用稀釋液？
為使檢測端的金標單抗與霍亂弧菌?O1菌體抗原A（O139）更充分地結合，要使霍亂弧菌抗原充分暴露，有必要使用稀釋液裂解細菌，這?一方面可提高檢測敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。我們查閱了有關文獻，并多次實驗驗證，選擇了特異性的稀釋液裂解細菌，所以在檢測時，一定要將標本與稀釋液充分混合，裂解細菌，只有這樣才能提高檢出率，達到盡早篩查疑似病人，控制疫情的目的。?
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