小分子RNA（miRNA）簡介
一、什么是小分子RNA（ MicroRNA）?
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? MicroRNA (miRNA) 是一類長度約為20-24個核苷酸長度的具有調控功能的非編碼RNA。 miRNA
主要參與基因轉錄后水平的調控。這些miRNA基因首先在細胞核內轉錄成原始miRNA轉錄本（primary transcripts
miRNA,pri-miRNA），在核糖核酸酶Drosha的作用下剪切形成約60-70nt
的發卡狀miRNA前體（或者稱為pre-miRNA），然后Ran-GTP /Exportin
5將pre-miRNA轉運到細胞質，隨后，另一個核糖核酸酶Dicer將其剪切成約為20-24個核苷酸長度的miRNA
:miRNA雙鏈。這種雙鏈很快被載入RNA誘導沉默復合體（RISC）中，之后其中一條單鏈miRNA被降解，另一條成熟的單鏈miRNA分子通過與靶基因的3’UTR區互補配對，對靶基因進行降解或者翻譯抑制。
二、miRNA的特點
? ? 1． miRNA 在反復凍融，PH改變，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的穩定性。
? ? 2． 相同的miRNA在不同細胞、不同組織器官以及不同種屬之間具有相似的序列以及調控功能。
? ? 3． miRNA在不同組織、不同細胞間的表達譜表現特征不同，因此miRNA表達譜可以作為某些組織或細胞的特異性分子標志。
? ? 4． miRNA的組成在細胞的不同發育階段不同，特定的miRNA在特定細胞的特定階段出現，決定細胞的分化方向和分化時相，因此miRNA是細胞定時、定向分化的開關。
? ? 5． miRNA的調控不是一一對應的，而是同時調節一組功能相似或相近的蛋白。
? ? 6． miRNA的調控力度不是很強，一般僅占蛋白表達量的30%或以下。
三、為什么miRNA會成為研發熱點？
1． 作為生物標志物
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? 首先，miRNA在不同組織，不同細胞以及細胞的不同發育階段組成不同，是“天生的”良好標志物；其次，miRNA
穩定性甚佳，在反復凍融、PH改變、DNA以及RNA裂解酶的作用下都不容易降解，比較容易獲得；
還有，miRNA的調控為一控多，這也決定了miRNA的數量不會太多，最新數據顯示人體內發現的miRNA總數為1048條。綜上所述，miRNA具備了很多優質生物標志物所應具備的特點。
2． 作為潛在藥物靶點
? ? 由于miRNA是通過對一組功能相似的蛋白進行溫和調控以達到功能調控的目的，因此通過阻斷miRNA來調控生理功能理論上對于生物體本身會相對安全。因此miRNA是很好的潛在藥物靶點。
3． 作為基礎研究對象
? ? 通過對miRNA功能的研究，可以把蛋白質按照功能重新分類，從而可以發現一些已發現蛋白的新功能，并與新的信號通路聯系起來，推動基礎科學研究的進步。
四、miRNA的檢測方法
1. 深度測序 (Deep Sequencing)
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深度測序是一種最新的高通量測序技術，它一次可以同時對幾十萬至幾百萬條DNA進行測序。深度測序可以對一種生物、組織或細胞器進行基因組、轉錄組或代謝組進行全面、深入、細致的分析。通過深度測序技術，我們可以對未知的miRNA進行探索發現，對已知的miRNA進行初步的定性半定量分析。
2. 基因芯片（Micro-Array)
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基因芯片技術興起于20世紀90年代，它是一種快速的、高通量的通過核酸雜交反應的原理來測定基因表達量的技術。基因芯片技術的出現使得對成千上萬基因表達同時進行檢測成為可能。近年來隨著miRNA研究逐漸成為熱點，用于檢測miRNA的芯片產品也越來越多。該技術最主要的優勢為具有極高的檢測通量，同時檢測成本較低。但是由于技術本身的限制，基因芯片只能顯示出2倍以內的表達差異，因此也是屬于定性半定量檢測技術。
3. 實時熒光定量PCR (Real-time qPCR)
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? 實時熒光定量PCR技術是1996年由美國Applied
biosystems公司推出在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。該技術在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA
(或cDNA) 的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA (或cDNA)拷貝數最敏感、最準確的方法。
? ? 目前市場上miRNA qPCR檢測方法主要有以下兩種：1. 兩步法； 2.三步加尾法。兩種方法的主要差別在于qPCR之前的
cDNA制備過程（如圖）。其中兩步法是通過獨特設計的莖環結構引物進行反轉錄將miRNA反轉錄成cDNA。而三步法則是給miRNA序列加polyA尾，之后再利用反轉錄過程將miRNA反轉錄成cDNA并加上獨特設計的尾部序列。
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? 兩步法的優勢在于特異性很高，但是最新的研究報道顯示在編輯過程中，miRNA
的3’序列的多樣化現象(Heterogeneity)，這種現象的發生使得目前市場上qPCR兩步檢測法的準確性受到影響（如圖）。而三步法則不受這一現象的影響，而且隨著科學家們的不斷摸索創新，三步法的特異性如今已經可以和兩步法媲美。更重要的是低廉的價格也是三步檢測法越來越受到廣大研發人員喜愛的重要原因。五、miRNA的應用舉例
1． 免疫學應用 （T/B 淋巴細胞）
? ? 研發人員監測大量已知miRNA在免疫反應中表達的變化， 從而發現其在生理病理狀態下的重要作用。除此之外研發人員還可以發現和鑒定出新的生物標志物，從而達到監測免疫細胞的信號轉導和組織器官的分化的目的。
2． 干細胞領域的應用
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由于miRNA細胞特異性以及“時空”特異性的特點，近年來其在干細胞定向分化和自我更新功能維持中的作用，逐漸被科學家們發現。通過監測大量已知miRNA在免疫反應中表達的變化，研發人員可以在較短的時間內發現新的干細胞分化的標志miRNA；
此外通過對已知的miRNA標志物表達量的檢測，可以達到對干細胞的多能性以及分化進行監測的目的。
3． 癌癥領域的應用
? ? 根據國內外的相關報告，某些miRNA在腫瘤的發生和發展中起著重要的作用。
? ? 根據miRNA在人體中起到的調節蛋白生成的特殊作用，我們認為其在未來臨床檢測應用方面具有廣闊的前景。
