DNA序列和大規模DNA測序策略的探討（圖）
人類基因組計劃的核心內容之一是基因組測序。隨著人類基因組圖譜趨于完成，人類基因的 定位克隆、鑒定分析直至全基因組測序取得了突破性進展，測序策略的成熟、測序方法的改進、自動測序儀的廣泛應用、計算機數據分析系統的擴展以及測序分析能力的提高， 大大推進了大規模DNA測序的進程。
第一節 DNA測序的基本方法
一、Maxam-Gilbert的化學降解測序法
①先用限制性內切酶把DNA切成10～200bp 的測序材料，②用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5′末端上的磷酸，③在5′OH端標記32P，用多核苷酸磷酸激酶催化，④標記片段變性為單鏈，⑤化學試劑在特定堿基位置降解單鏈DNA，產生一組長度不等的DNA片段，⑥經電泳和放射性自顯影后，從4個反應系統統一閱讀，待測DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出。
二、Sanger的酶降解測序法（鏈終止法）
這項技術的關鍵是在DNA的聚合過程中依賴特殊反應底物（2′3′-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP）的特異性終止進行DNA測序。
第二節 DNA測序的策略
一、定向測序策略
定向測序策略是從一個大片段DNA的一端開始按順序進行分析。傳統的方法是用高分辨率限制酶切圖譜確定小片段的排列順序，然后將小片段亞克隆進合適的克隆載體并進行序列分析。
二、隨機測序戰略
隨機測序戰略又稱鳥槍戰略（shotgun strategy），此策略是將人類基因組DNA用機械方法隨機切割成2Kb左右的小片段，把這些DNA片段裝入適當載體，建立亞克隆文庫，從中隨機挑取克隆片段。最后通過克隆片段的重疊組裝確定大片段DNA序列。
三、多路測序戰略
多路測序戰略（Multiplex method）是鳥槍法的一種發展策略，是通過多個隨機克隆同時進行電泳及閱讀，快速分析DNA序列的一種技術。這種方法的復合隨機克隆文庫來源于相同的基因組DNA。將DNA片段克隆到20種不同的質粒載體上，再亞克隆進不同的質粒載體。將來源20個亞克隆庫的克隆。
四、聚合酶鏈式反應（PCR）
反應程序包括三個步驟：(1)DNA雙鏈加熱(94℃)變性成單鏈；(2)加入兩種DNA單鏈引物，分別與兩條模板鏈退火（55℃）；(3)DNA聚合酶從兩引物的3′端按模板要求合成新生DNA鏈（72℃）。重復操作，可使DNA快速擴增，20個循環后可使模板DN A擴增1萬倍，30個循環后可使模板DNA含量放大100萬倍，只需2個多小時的時間。?
五、大規模DNA測序的趨勢——自動化
DNA測序實現規模化的重要條件是自動化和機械化。目前，DNA制備、克隆文庫組建及篩選、DNA測序分析、數據的分析獲得、堿基序列閱讀、重疊克隆群順序排定等過程均已平行發展，自動化操作緊隨其后。隨著DNA測序不斷由半自動化向自動化過渡，原始數據積累將不成問題，關鍵是把全基因的散測序組裝起來，以實現DNA測序的完整性。目前，在亞克隆篩選、模板制備、測序反應、堿基閱讀等方面均在一定程度上實現了自動化。
1、 克隆篩選 從亞克隆文庫中尋找并篩選單一克隆已逐步實現了自動化。
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2、模板制備? 現有的機器人被用來自動分離DNA并制備適于傳統操作程度的測序模板。特定用途的DNA分離儀也已采用。
3、 測序反應 由于手工測序不能保證所需的再生產能力、高通量和準確的重復性，所以，DNA 測序反應的自動化對大規模測序是至關重要的。
4、自動放射性自顯影閱讀機 近幾年來，自動化放射性自顯影閱讀機紛紛上市，并不斷向商業化及科研應用方向發展。
5、自動測序儀 DNA自動測序儀的應用實現了凝膠電泳、初始數據獲取、堿基閱讀等步驟自動化。
第三節 未來的測序技術
一、質譜法（mass spectrometry）
新型的電離技術如電噴霧離子化和基質輔助激光吸收技術使利用質譜法 分析大片段DNA成為可能。其中四極離子捕獲效果更好。Fourier轉型質譜或飛行時間質譜可進行極為敏感的DNA測序。
二、雜交測序法（seguencing by hybridization，SBH）
雜交測序法是一種創新性的DNA測序技術，主要是采用一系列n-mer長的所有可能的寡核苷酸與未知DNA靶序列進行雜交，記錄下最適的雜交片段，然后組裝便可獲得未知片段的堿基序列。
三、單分子測序法（single-molecule seguencing）
單分子測序法是美國Los Alames國家實驗室（LANL）)發展的一種通過檢測標記在單個分子上的熒光進行DNA快速測序的方法。模板DNA分子首先通過酶法修飾或合成，使不同的熒光素標記不同的堿基，然后，用兩個激光束（或稱激光鑷子lasertweezer）夾住標記的DN A分子，將其置于液流系統，從被固定的核苷酸上游端開始用外切酶逐一切下被標記的核苷酸，通過單分子熒光探測器檢測液流中切下的標記核苷酸，再根據檢測到的信號順序確DNA順序。
四、原子探針顯微鏡測序法（atomic probe microscopy）
80年代發展的原子探針顯微鏡技術如掃描遂道顯微鏡（scanning tunneling micro scopes，STM）和原子力顯微鏡（atomicforce microscopes，ATM）使直接檢測DNA分子結構成為可能。STM是由IBM Zurich研究所的科學家發明的用來直接觀察單分子、單原子結構的技術，最近有人將其應用于閱讀DNA序列。
五、超薄水平凝膠電泳技術（Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis，HUGE）
1990年，Swerdlow H首次采用HUGE技術進行DNA測序研究。該技術是在單一超薄凝膠平板上放入多道平行樣品，在超高壓電場作用下，通過HUGE檢測系統進行測序。
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技術原理
