結核分枝桿菌感染診斷方法的進展
?結核病是人類最古老的傳染病之一， 是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）所致以呼吸系統感染為主的慢性傳染病，至今依然是單一感染因素引起死亡人數最多的疾病。我國的結核發病率位于世界第二，感染率為44.5％。現有的結核診斷方法存在諸多不足。臨床癥狀和影像學特征有助于疑似患者的發現，但進一步診斷需要結合實驗室檢測。結核現有早期診斷手段有涂片鏡檢和分子檢測等方法。涂片鏡檢雖然使用廣泛，但敏感度低且易受非結核分枝桿菌的干擾。而MTB的分子學診斷雖然在涂陽標本中檢出率高，但只能檢出50％左右的涂陰標本，且分子診斷操作復雜、容易交叉污染，也在一定程度上限制了其在基層的推廣應用。MTB分離培養是目前結核診斷的金標準，不僅具有較高的檢出率，且能對菌種進行鑒定，但耗時較長（一般需培養6-8周），作為早期診斷的意義不大。MTB感染后機體主要的免疫反應為T細胞免疫，其血清抗體檢測的意義不大。
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? ? 全球結核菌感染者中，超過95％表現為潛伏性結核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）。LTBI仍可發展為活動性結核，成為主要的傳染源。因此，準確診斷結核菌潛伏感染，對于結核病的預防具有十分重要的意義。由于潛伏感染者缺乏特異性癥狀，而且目前診斷結核潛伏感染還沒有統一的標準和方法，因此很難在健康人群中快速檢測出結核潛伏感染患者,特別是在其臨床癥狀還沒有出現時。
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? ? 一、結核菌素皮膚試驗
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? ? 臨床上用于判斷結核分枝桿菌感染的首選方法是TST（tuberculin skin test，結核菌素皮膚試驗），即皮內Mantoux試驗以及PPD試驗，主要以純化蛋白衍生物（PPD）和舊結核菌素（OT）為抗原進行皮下注射的診斷方法。TST從1890年發明以來沿用至今，用于結核病的診斷已超過100年，是目前還在應用中的一種古老的試驗方法。目前國內診斷潛伏感染主要依據結核菌素皮試（PPD皮試）的結果，一般將PPD強陽性或短期內從陰性轉為陽性，而無臨床結核病證據者判斷為結核菌潛伏感染者。此法所需費用較少，簡單易行。
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? ? TST的缺點首先是特異性不夠好。PPD是從結核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，包含200多種蛋白，其中很多是非結核分枝桿菌及卡介菌（BCG）的共同抗原成分。對于卡介苗（BCG）作為常規接種疫苗的國家，TST的陽性或者弱陽性結果很可能是由BCG接種引起的，同時不能除外非結核分枝桿菌（NTM）感染。在中國結核病高度流行地區，由于廣泛接種BCG，TST會造成假陽性；而在HIV感染患者、自身免疫性疾病、老人和幼兒等免疫力低下的人群中容易出現假陰性。其次，TST對潛伏性結核分枝桿菌感染（Latent Tuberculosis Infection，LTBI）的敏感性一般，而且對于免疫抑制者結果難以確定。另外，TST檢測還存在費時（48-72小時）、需要受試者回訪、皮試操作和結果解釋存在主觀依賴性等缺點。
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? ? 二、γ-干擾素釋放試驗
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? ? 近年來，有一類用于診斷結核分枝桿菌感染的新方法進入了人們的視線，即γ-干擾素釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRA），這類試驗采用ELISA／ELISPOT（酶聯免疫吸附/酶聯免疫斑點）方法定量檢測檢測全血/外周血單核細胞在結核菌特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素的水平，用于診斷潛伏性結核分枝桿菌感染以及結核病。目前這類γ-干擾素釋放試驗中，有兩種較為成熟的方法，即Quanti FERON-TB GOLD試驗（QFT-G）和T-SPOT TB試驗。其對應的方法和試劑盒先后被美國FDA批準應用于臨床，CDC為其指定了使用指南。
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? ? （一）IGRA的理論和基礎研究
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? ? 人體對于結核分枝桿菌感染的免疫反應主要是細胞免疫。T淋巴細胞和巨噬細胞的作用關系到感染的進程和演變。巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌后，就會把它們消化成大小不一的片斷。特異片斷（抗原肽）與巨噬細胞和其他抗原遞呈細胞的主要組織相容性復合體（人白細胞抗原）相結合，表達于巨噬細胞表面，并遞呈給T細胞。特異性CD4 T細胞能產生特征性淋巴因子，包括一種能夠刺激T細胞增殖的生長因子白介素-2和一種巨噬細胞反應中介物γ-干擾素，γ-干擾素為巨噬細胞殺菌機制所必需。
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? ? IGRA將結核菌特異性抗原加入受試者的血液標本或者含有分離出的外周血單核細胞的培養基中進行孵化，如果受試者受到過結核分枝桿菌感染，那么被結核菌激活的記憶T細胞就會對這些特異性抗原產生反應，發生增殖分化并釋放出γ-干擾素以及其他一些細胞因子，我們可以通過ELISA/ELISPOT方法定量檢測γ-干擾素的釋放水平。通過這樣的試驗，我們可以診斷是否存在結核菌感染。IFN-γ為Th1細胞分泌的一種細胞因子，不但能夠反映機體結核的Th1細胞免疫情況，還與體內結核菌的抗原含量密切相關。被結核分枝桿菌抗原致敏的T細胞再遇到同類抗原時能產生高水平的IFN-γ，因此被用于結核潛伏感染的診斷。
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? ? 整個試驗體系中，對于結核菌特異性抗原的選定是至關重要的。γ-干擾素釋放試驗誕生的早期曾使用PPD作為特異性抗原，由于PPD成分不單一，特異性和敏感性均不理想。后來研究者開始使用ESAT-6和CFP.10作為抗原，得到了較好的效果。ESAT-6（早期分泌抗原靶6 000蛋白,early secretory antigenic target 6）和CFP-10（培養濾出液蛋白-10，culture filtrate protein 10）的蛋白編碼來源于結核分枝桿菌基因中的一個菌種特異性基因片斷，稱為region of difference 1（RD1）。這個基因片斷不存在于大部分的非結核分枝桿菌以及所有的牛型分枝桿菌（包括卡介苗）中，因此ESAT-6和CFP.10作為抗原的特異性相對于PPD要高的多，這個顯著的優異性也使得γ-干擾素釋放試驗得以應用于臨床。
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? ? 目前QuantiFERON-TB GOLD和T-SPOT TB的試劑盒主要以這兩種抗原為基礎。其中，QFT-G又出現了一種用試管的改良方法，稱為QFTGIT（QFT-in Tube）。某些TIGRA試驗除了上述兩種抗原外，還常用TB7.7抗原。TB7.7是結核分枝桿菌基因組差異區13（RD13）基因編碼的結核桿菌特異性抗原團。這三種抗原在BCG和絕大部分環境分枝桿菌中都缺失（除外堪薩斯分枝桿菌、海水分枝桿菌和蘇加分枝桿菌），因此避免了與卡介苗和大多數非結核分枝桿菌抗原的交叉反應。
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? ? 此外，對于新抗原的研究開發依然沒有停止，近年來發現的肝磷脂結合紅血球凝集素（Heparin-Binding-Hemagglutinin，HBHA）是新一代結核菌特異性抗原中較為突出的一個。這是一種結核分枝桿菌表面蛋白，其作用和結核的潛伏感染相關。潛伏感染者會對于HAHB產生強烈T細胞反應，而活動性肺結核則不會，因此這是一個非常有潛力的新抗原。
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? ? （二）IGRA的應用
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? ? IGRA目前還只在少數國家被應用于臨床，主要是用于檢測結核菌潛伏感染，此外該試驗還被用于活動性肺結核的診斷、預測和鑒別診斷。近年來，一些使用IGRA檢測胸水以及支氣管肺泡灌洗液中的T細胞反應以檢測結核分枝桿菌感染的試驗也取得了較好的效果，為這類試驗的應用拓展了新思路。
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? ? 1、篩選結核菌潛伏感染
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? ? 篩選結核菌潛伏感染是IGRA最成熟的應用領域。在這方面IGRA比TST的特異性要高，尤其是對于卡介苗接種過的人和NTM感染者。大量試驗數據證明，對于潛伏感染，IGRA試驗的特異性在90％以上，對于低危險人群的特異性則達到了95％以上。
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? ? 目前對于結核潛伏感染的敏感性難以確定，因為沒有一個金標準能判斷是否真的有潛伏感染。不同地區的相關報道結果有較大的差異，高危人群和低危人群有所不同。
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? ? 2、診斷活動性結核
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? ? IGRA難以區別近期結核分枝桿菌感染與活動性結核病，但是用于活動性結核與其它疾病的鑒別很有意義。大量數據提示，QFT-G試驗的敏感性從55％-88％不等，平均大概75％左右。這個和TST（平均77％）差不多。而T-SPOT的敏感性比QFT-G高，因為該試驗檢測到的干擾素就在產生干擾素的細胞周圍（一旦產生，就被結合了），而QFT-G試驗檢測到的是已經彌散在反應體系中的干擾素。
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? ? 由于胸水中免疫反應的強度比血液中更高，因此有些試驗通過檢測胸水中的γ-干擾素釋放水平來診斷活動性胸膜結核，這些嘗試被證實是有意義的。
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? ? 腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種促炎細胞因子，在多種自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-γ的治療會導致潛伏性肺結核轉變為活動性肺結核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制，TST容易產生假陰性。研究顯示，QFT-G和T-Spot.TB在免疫介導炎癥疾病（IMID）患者中檢測LTBI的敏感性和特異性都比TST高。終末期腎病（ESRD）患者感染結核分枝桿菌的幾率比健康人高10-25.3倍。
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? ? 3、確診陽性或者弱陽性的PPD結果
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? ? 由于對于潛伏感染的特異性要比TST高的多，因此IGRA用來確認一個陽性或者弱陽性的PPD結果是很有意義的，尤其是對于BCG接種者、確診或者疑似的NTM感染者以及面臨預防性抗癆的患者。
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? ? 關于IGRA的可重復性，有較多的相關試驗均表明，IGRA并無助強效應（booster phenomenon）以及類似反應，可以反復進行。2003年美國CDC發布的指南中提到，使用PPD進行TST檢測以后會影響QFT（第一代）的結果，因此QFT不能作為TST的補充診斷；但是后來2005年發布的關于QFT-G的相關指南就沒有提到這個問題，可能是因為后來使用了其他抗原代替PPD以后，就沒有了互相影響。目前關于IGRA確診陽性或者弱陽性的PPD結果的實際效果還沒有得到大量臨床資料證實。
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? ? （三）TIGRA和TST的比較
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? ? 評價結核潛伏感染診斷方法的最大問題是缺乏結核潛伏感染的診斷金標準，無法直接測量QFT-GIT、T-Spot.TB和TST方法的敏感性和特異性。許多研究都比較了QFT-GIT、T-Spot.TB和TST方法在結核診斷中的表現。QFT-GIT和T-Spot.TB結果具有統一性，它們都比TST更準確。許多研究結果顯示QFT-GIT可以取代或輔助TST對LTBI的診斷。TIGRA比TST更敏感、特異性更強。因為TIGRA所用抗原是結核分枝桿菌所特有的，而且其操作過程和實驗原理更加完善和先進。
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? ? 結核分枝桿菌感染診斷方法的進展
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? ? TIGRA的敏感性和特異性都強于TST，特別是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼兒等免疫力低下人群的檢測中。全球有約1300萬人共同感染了HIV和結核桿菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷，更容易從潛伏感染發展為活動性肺結核。
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? ? TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的兒童中，對LTBI的檢出率更高。但是，TIGRA存在無法區分活動期和潛伏期結核、需要抽血獲取淋巴細胞、要求專業的操作人員和具備相應條件的實驗室、樣品必須在采集后8h內完成等缺點，現階段仍未能完全取代TST。另外，現階段研究的樣本都非常小，也沒有診斷LTBI的金標準。
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? ? （四）IGRA的優點和缺點
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? ? 1、IGRA的優點
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? ? IGRA用于判斷結核菌感染的特異性明顯高于TST試驗，并且不受卡介苗接種的影響，這對于結核的診斷和預防是非常有意義的，尤其是在卡介苗接種率高的國家。這個試驗在24小時之內就可以獲得結果，花費的時間比TST短，并且不會因為助強效應受到影響，可以反復進行；此外，該試驗受到主觀因素的影響相對較小。在有試驗條件的醫院里，該實驗的操作和管理比TST更便捷，不需要專門的醫生多次觀察結果。
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? ? 2、IGRA的缺點
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? ? 對于我國目前的醫療背景來說，該試驗最大的缺點就是試驗成本高，這限制了該試驗的推廣。目前該試驗在我國國內的試驗資料非常少，對于我國人群的判斷標準還沒有定論，同時該試驗對于試驗室基礎條件也有一定要求。
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? ? 此外，該試驗還有一些固有的缺點：首先，時間窗較窄，因為血細胞在體外活性迅速減弱，因此8小時內必須在標本里加入抗原進行孵化；其次，該試驗對于結核近期感染和活動性結核的鑒別能力較差。雖然有報道稱使用HBHA作為抗原可以明確鑒別結核分枝桿菌感染和活動性結核，但是缺少足夠的試驗數據。
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? ? 該試驗結果在一定程度上受到T細胞水平的影響，對于免疫抑制或者免疫缺陷者可能會結果不準確，此外對于某些血液病、惡性腫瘤、矽肺以及慢性腎衰者，也缺少足夠的數據基礎。雖然有資料表明，干擾素釋放試驗對于HIV患者感染結核菌也有診斷價值，但是沒有足夠的臨床研究證實。
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? ? 三、其他潛伏感染診斷標志物和方法
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? ? 結核分枝桿菌潛伏感染的相關蛋白可以作為血清學標志物。Hsp16.3是由結核分枝桿菌hspX基因編碼的蛋白，最初被認為是免疫顯性抗原，后來被確認是一個重要的膜抗原，它的表達與結核分枝桿菌的休眠密切相關。肝素結合血凝素（HBHA）是結核分枝桿菌的表面蛋白，它可以引發細菌的聚集和吸附于非吞噬細胞。TIGRA不能百分之百地檢測到LTBI，因為ESAT-6和CFP-10在潛伏感染時不是高表達的。NarX和NarK2在BCG中不表達，但在潛伏期的結核感染中表達。因此，它們對LTBI的檢測更敏感，而且它們可以區分潛伏感染和BCG接種。CFP21和MPT64是由RD2編碼的結核分枝桿菌特有的診斷性質抗原。
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? ? IFN-γ誘導蛋白10（IP10，又名CXCL-10）其相對分子質量約為10×10^3。IP10是CXC家族的趨化因子，對T細胞和B細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞、嗜堿性粒細胞等有較強的趨化和功能活化作用，對于正常生理條件下淋巴細胞的循環、代謝和數量的穩定，以及免疫損傷局部對淋巴細胞的趨化均有重要作用。IP10還廣泛參于某些病理生理過程，如調節免疫細胞的分化發育、體內的遷移和分布等。IP10在趨化效應T細胞到Th1型細胞主導的炎癥部位中發揮重要作用。
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? ? TIGRA通過測量IFN-γ的釋放量來診斷LTBI。白細胞介素7（IL-7）是一種細胞因子，能夠穩定IFN-γ的分泌和提高蛋白產量。用IL-7提高IFN-γ檢測的敏感性可以增強對LTBI的檢測，特別是對免疫力低下的患者或兒童。
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? ? 快速診斷結核分枝桿菌感染對于預防和控制結核病是非常重要的，臨床上需要動用多種手段綜合分析，做出判斷。同時結核桿菌可長期以休眠狀態存活，并可被重新激活而致病，及早診斷潛伏結核感染者，是控制結核傳播的重要手段之一。目前，國內以TST作為主要檢測手段，但TST的結果容易受到卡介苗和受試者免疫狀態的影響。國外常用的TIGRA檢測方法彌補了TST的上述缺點，但是不能區分活動性和潛伏性結核感染者。γ-干擾素釋放實驗，顯示出了很多超越TST的優點，對于判斷結核分枝桿菌感染有可靠的參考價值，隨著方法的改進以及新抗原的應用，以后可能會成為新一代的診斷方法。
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