自動生化分析儀基本參數及應用（二）
三、樣品量、試劑量與稀釋量
有關參數包括樣品量、試劑量、稀釋水量、最小反應體積和最大比色杯容量等。如HITACHI7170反應體積180~380μl，最大體積570μ l。BT 224半自動生化儀流動比色池容積33μl，吸液量200～990μl，最適體積500μl。
1．最小反應體積?? 在儀器光度讀數要用于結果計算時，反應液液面高度不低于光度計光徑的最小體積。它保證儀器的正確讀數和計算，也是儀器測定精度和經濟性的指針之一。在有的儀器中，它以反應體積的下限表示，有的則專門標明最小反應體積。在單試劑測定中，樣品與試劑的總體積不得少于此參數。在雙試劑測定中，若R1與樣品的反應讀數不納入結果計算。R1自勺加液量可不考慮此參數，如連續監測法；否則應考慮它對結果的影響，如終點法在加R2之前讀數，并以此來扣除試劑或樣品空白時。
在半自動生化儀中，最適吸人量相當于最少反應體積。它與進液管道長度、流動比色池容積，吸液泵抽吸力大小和液體黏稠度有關，它要保證光度檢測不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。因此，吸人體積不能任意降低，必要時，應加大反應液量和吸人量。
2．最大比色杯容量?? 這個參數含義明確。在有的儀器中，它以反應體積的上限表示，有的則專門標明最大比色杯容量。反應液超過此體積，將致液體外溢，儀器測定系統被污損。
3．樣品試劑比例樣品與試劑的比例(SV：RV)，也可表示為樣品體積分數——樣品體積與反應液總體積的比值(SV／TV)，是方法學基本參數。酶活力測定中，樣品在總體積中的比例應在10％以下。一般來說，待測物質在樣品中含量低的、生理波動范圍大的，樣品用量較大。如Trinder反應測定血清葡萄糖、膽固醇等，樣品試劑比例多為1：1OO，測定血尿酸或高密度脂蛋白膽固醇，常增加為1：50；ALT和AST的樣品試劑比例多為1：1O至1：20。方法靈敏、吸光度高的實驗方法，樣品試劑比例小,如白蛋白BCG法，樣品試劑比例常為1：200。肌酐Jaffe氏法監測時間短、吸光度值較低，樣品試劑比例多為1：10。一般應以試劑說明為準，不宜輕易改動。
(1)改動樣品試劑比例，影響一系列方法學參數。若比例增大，則線性范圍縮小，線性反應時間縮短，樣品內源性干擾、基質效應增加、旁路反應會增強，方法特異性也下降。若比例減少，檢測信號偏低，信噪比(噪音／信號)增大，當儀器精度不高時，會加大測量誤差。
(2)改動樣品試劑比例，對某些反應有影響。如堿性磷酸酶(AI_P)，有文獻報道：當樣品試劑比例從1：25降至1：50時，酶活力測定值增加，再低于1：50時不再增加。這一效應可能是較高稀釋度下AIJP多聚體解聚的結果。體液樣品稀釋也可能對測定結果產生影響：④大多數蛋白質在濃溶液中的分子構象比稀溶液中穩定，樣品稀釋可影響酶的穩定性。(2)降低樣品中內源性抑制劑或激動劑的濃度，如以蒸餾水稀釋血清，可能因降低血清中淀粉酶的激動劑氯離子的濃度，致測定淀粉酶結果偏低；隨血清稀釋倍數增加，肌酸激酶測定活力增加，可能與降低樣品中AMt，、胱氨酸等內源性抑制劑有關。
(3)雙試劑時要兼顧R1、R2和樣品三者的比例，尤其不宜改動試劑間的比例。R2要考慮儀器規定的加液最小體積，同一試劑瓶死體積下分液量小而浪費大的經濟問題等。
4．稀釋(水)量在加樣或加試劑時，加入去離子水或可以指定的液體。它的主要用途有兩個。一是用于濃縮試劑的稀釋，或樣品、校準品的稀釋。二是在樣品加量小的時候用來沖洗樣品探針，減小攜帶誤差；但用量不宜太多，以免稀釋試劑影響反應。要把稀釋水量納入樣品試劑比例和反應液總體積考慮。必要時，干粉試劑復溶也要考慮此因素。
四、試劑空白(Reagent blank)監測參數
無樣品或以水代替樣品在反應過程中觀察試劑空白值或其變化情況，主要用于監測試劑質量及儀器穩定性，利用試劑空白對試劑本身或反應漂移引起的誤差進行補償，用以校正△A或△A/min。它與測定波長、光徑大小、不同試劑及配方和樣品試劑比例等有關，不能盲目套用，必要時宜實際測定。
1．試劑吸光度上限和下限定點監測試劑的吸光度。它常用規定波長及光徑下的吸光度值表示。儀器的試劑空白檢測點因儀器和測定方法的不同而有差異。終點法常在PO點讀數，連續監測法常以反應監測起始點來判讀。儀器在試劑空白檢測及相關的校準測定時，若監測到超過此參數的限值，則提示試劑失效或校準無效。反應吸光度向上的試驗取上限值：如Trinder反應以酚或2-羥-3，5-二氯苯磺酸等和4-氨基安替比林作用，生成紅色色素，試劑有一定的自發氧化，其試劑一般要求試劑吸光度上限≤0. 1-0. 4。以結合型硝基苯衍生物作為底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反應吸光度向下的試驗取下限值：如以NADH或NADPH為輔酶的ALT和Urea(紫外法)等試驗，一般要求試劑吸光度下限≥1．0。
2．試劑空白速率顧名思義，它是在反應過程中對試劑空白的變化速率作連續監測，其數值在樣品測定結果中自動扣除。試劑中可能混有的其他雜酶或干擾物對試劑空白速率有影響。在酶促反應中，試劑空白速率也是試劑在監測過程中底物自發降解的結果。底物為還原型輔酶者，本身不穩定而分解，多呈下降趨勢；以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物，在堿性環境中自發水解成被測物質，多呈上升趨勢。此參數主要用于連續監測法。一般認為酶活性測定的試劑空白速率(△A/min)應≤0. 001~0.003。由于試劑空白速率與儀器檢測下限、正常參考范圍下限等指標有關，有時也以濃度單位表示。要根據K值、儀器穩定性、方法允許變異而定。例如，ALT或AST40U/L以下活力濃度的分析誤差應≤10％，其試劑空白速率應≤4．0U／L。一些儀器的程序參數中沒有此參數，但我們應在試劑空白的測定資料中關注它，若資料波動大，須查找試劑或儀器原因。
3．試劑空白的日常監測測定方法設置了試劑空白的項目，都要先行作試劑空白測定，在樣品測定計算中自動扣除。由于試劑空白不是在每一個樣品測定中實時測定并扣除，當樣品測定中試劑的變化在未達到參數設置限值時不易發現，試劑空白扣除會產生誤差。所以，應根據試劑的穩定性確定試劑空白及相關的校準的測定頻率。連續監測法的試劑應每天(尤其在換另瓶或另批號試劑時)常規測定此參數。對樣品的異常結果．也應及時對其測定吸光度資料(包括與試劑空白有關的資料，例如PO點讀數)觀察分析。
4.有的半自動生化儀沒有試劑吸光度上限和下限設定，但一般在測定屏幕都顯示初始吸光度值，應人工加以判斷。酶活力測定結果呈負值，有時可能與試劑空白錯誤有關。
5．試劑吸光度上限和下限不是試劑質量的唯一指針。因此，一定的校準頻率和室內質控是質量保證的必需手段。我們在實際工作中就遇到酶活力測定的試劑空白數據在規定限值內，但質控物測定結果連續偏低，病人結果因每天標本少而難以判斷，最后發現是試劑質量下降。
五、波長的選擇及測定模式
波長（Wave 1ength)的正確選擇有利于提高測定的靈敏度和減少測定誤差。光度學方法有單波長和雙波長之分，有的儀器可用三波長、甚至多波長，以及兩波長比率等。有的儀器可作導數光譜分析。單波長測定易受樣品溶血、黃疸、脂濁等因素干擾。雙波長測定可以通過副波長加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測定準確性。采用同光束雙波長，亦有利于排除光源強度變化對結果的影響。
1．測定波長選擇有三個主要條件：
(1)待測物質在該波長下的光吸收最大。
(2)其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話說，該吸收峰處的吸光度隨波長變化較小。
(3)常見干擾物在該波長下的光吸收最小。試劑盒說明一般已提供波長參數。實際波長選擇需要了解待測物質和干擾組分對不同波長單色光的吸收程度，即以波長為橫坐標、吸光度為縱坐標作吸收光譜曲線(光吸收曲線)。
采用透射免疫比濁法，免疫復合物大小約35~100mn之間，于波長290~410nm下有最大吸收峰，常取340nm；如用膠乳增強免疫濁度法，理想的檢測波長可增至可見光區。
2．雙波長測定當待測物質與干擾組分的吸收光譜互相重疊、出現非特異光吸收，或因反應液混濁出現光散射時，可以采用雙波長(或多波長)測定。雙波長測定的原則是根據干擾組分和待測物質吸收光譜的峰形特征，選擇兩個波長和 ，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數相等，而使待測物質在兩波長處的吸光系數有顯著差別。以兩波長分別測定分析溶液的吸光度，以兩個吸光度值之差(△A)計算。雙波長選擇常見：血紅蛋白340nm和380nm波長吸光度相同，以NADH或NADPH作為測定底物或產物的試驗常采用340／380nm；有的也．采用340／405nm。ALP和GGT常使405/476nm，Trinder反應多選取520／600nm或550/660nm．免疫比濁常選用340／700nm等。
連續監測法中，要注意雙波長測定有兩種類型的機型：主波長全程監測副波長單點監測，和雙波長全程監測。不僅因為后者的準確性優于前者，而且因為酶活性測定的K值計算與波長及摩爾吸光系數有關，更顯重要。
副波長單點監測：試劑和樣品混合后，雙波長只測一點，此后只用主波長連續監測；計算時，全部x主吸光度值均減去同一λ副吸光度值。K值計算代入主波長摩爾吸光系數即可。機型如Monarch 1000 ，Technicon RA 1000等。
雙波長全程監測：全程每～測定點均用雙波長同測，并各自用λ主吸光度值減去λ副吸光度值。因為所測指示酶或產物在λ副波長時也存在一定的吸光系數，K值計算代入的摩爾吸光系數值應采用ε主減去ε副。如NADH的ε 為6．22×10 ， 為1．33×10 ，ALP產物ε 為18.5x×10 ，ε 為0.2×10 很小；GGT產物在副波長處無吸光系數。
