植物原生質體制備及轉化試劑盒使用說明
植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質體。許多方法可誘導原生質體融合，現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使原生質體融合得以完成。
本試劑盒含有除酶以外植物原生質體制備和轉化需要的全部試劑，按照一次使用10ml酶液計算，可以使用20次。
●?貯存和效期：
按照溫度貯存，有效期一年。
●?使用說明：
需要準備的材料（試劑盒不提供）：
纖維素酶R-10；離析酶R-10；平頭鑷子；70μm細胞過濾篩；一次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水浴鍋
一、原生質體分離：
即用型酶溶液配制
| 10ml?配制量 | 20 ml配制量 | |
| 溶液I（2×） | 5 ml | 10 ml |
| 纖維素酶R-10 | 0.15?克 | 0.3?克 |
| 離析酶R-10 | 0.04?克 | 0.08?克 |
| 還原劑 | 5 μl | 10 μl |
| 50mg/ml BSA | 0.2 ml | 0.4 ml |
| 滅菌水 | 定容至10 ml | 定容至20 ml |
注：即用型酶溶液現用現配。
1. 取生長狀態良好的葉片切成0.5-1mm的小條，按照20個葉片加10 ml即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，常溫酶解3小時。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態有關，請根據實驗需要適當延長酶解時間。酶溶液變為綠色表明有原生質體已經分離，顯微鏡鏡檢后確定是否分離。
2. 酶解后加入10 ml溶液II，輕柔混勻。
3. 用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50ml離心管中。
4. 濾出液100g常溫離心 2分鐘，去除上清。
5. 加1 ml 溶液II重懸原生質體，冰浴30分鐘（原生質體會自然沉淀于底部）。
6. 小心去除上清溶液，不要觸動原生質體沉淀，沉淀重懸于1 ml溶液III中即為原生質體溶液。
二、原生質體轉化：
取10μl質粒DNA(濃度為1 -2μg/μl)于1.5ml 離心管中。
2. 加入100μl原生質體溶液，輕柔混勻。
3. 加入等體積即110μl 溶液IV-轉化溶液，輕柔徹底混勻，常溫放置15分鐘，間歇輕柔混勻。
4. 加入2倍體積即440μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉化過程。
5. 常溫100g離心2分鐘，去上清。
6. 沉淀重懸于1 ml溶液V中。
三、原生質體培養和收集：
1. 原生質體溶液 常溫（20-25℃）孵育2-16小時。
注：根據實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時；酶活性分析和蛋白標記實驗孵育2-16小時。
2. 常溫100g離心2分鐘收集原生質體，去除大部分上清。
3. 原生質體沉淀重懸于剩余溶液中，-80℃貯存。
