四種黃連的紅外光譜鑒別分析
【紅外光譜與聚類分析結合對黃連進行準確鑒別】
黃連是一種常用的中藥，其味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。經過不同的方法炮制之后，可以得到酒黃連、姜黃連和萸黃連。酒黃連用于目赤，口瘡;姜黃連用于寒熱互結，濕熱中阻;萸黃連用于肝胃不和，嘔吐吞酸。不同方法炮制黃連的藥效有所不同，因此需要對其進行區分鑒別，以免混用。
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圖 1. Spectrum 100 傅里葉變換紅外光譜儀和單次反射金剛石衰減全反射(ATR)附件。
近年來，使用紅外光譜等方法對中藥進行鑒別和評價的研究日益增多。紅外光譜可以真實反映樣品的整體信息，避免了只針對個別組分進行檢測所產生的弊端;紅外光譜指紋特征性強，適合于中藥真偽品、不同產地中藥等的區分鑒別，以及中藥炮制過程的控制;紅外光譜與化學計量學結合，可實現快速簡便的成分定量分析;多種附件技術的使用，可以實現各種形態樣品的無損檢測;樣品無需分離提取等預處理過程，操作簡便，適合大量樣本的快速檢驗。
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實驗制備
樣品
生黃連、酒黃連、姜黃連和萸黃連由中國中醫科學院中藥研究所提供(酒黃連、姜黃連和萸黃連均按藥典規定方法炮制)
儀器條件
PerkinElmer 公司的Spectrum 100 傅里葉變換紅外光譜儀，單次反射金剛石衰減全反射(ATR)附件，光譜范圍 4000-650 cm-1，分辨率4cm-1，累加掃描1min以獲得一個樣本的光譜，使用PerkinElmer 公司的 Spectrum 和 AssureID 軟件對譜圖進行處理和統計分析。
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實驗分析
生黃連和炮制黃連的二級導數紅外光譜
生黃連和三種炮制黃連的紅外光譜如圖2所示。由于這幾種樣本的成分高度相似，其紅外光譜上的差異很不顯著。為了找出生黃連和三種炮制黃連的紅外光譜間的差異，需要借助二階導數紅外光譜和統計分析方法。
圖 2. 生黃連和三種制黃連的紅外光譜。
為了保證所發現的不同種類樣本之間的差異具有重復性，而非隨機誤差，對生黃連、酒黃連、姜黃連和萸黃連均各采集10個樣本，其中每類7個(共28個)作為校正樣本，用于尋找差異所在并建立聚類模型，另外每類3個(共12個)作為驗證樣本，用于驗證聚類模型的正確性。經過標準正態分布校正(SNV)的生黃連和炮制黃連校正樣本的二階導數紅外光譜如圖3所示。
圖3.歸一化后的生黃連和炮制黃連校正樣本的二階倒數紅外光譜。
在二階導數光譜上，生黃連和炮制黃連的差異比較顯著，特別是生黃連和酒黃連與另外兩種炮制黃連的差異較大。姜黃連與萸黃連的差異并不明顯，說明其成分極為接近，這與二者功效基本一致的事實相對應。
因此，在接下來的聚類分析中，將四種黃連分為三組：生黃連、酒黃連、姜黃連/萸黃連，所用光譜范圍為1250~1050 cm-1，均使用經過SNV歸一化的二階導數紅外光譜。
生黃連和炮制黃連的聚類分析(COMPARE)
COMPARE算法就是根據光譜相似系數(此處使用夾角余弦算法)的大小對不同種類的樣本進行聚類分析。在預先設定后樣本的分類歸屬后，分別計算每類樣本的平均光譜并以此為參照，比較各類樣本與相應參照光譜的相似系數是否有顯著性差異。與參照光譜同類的樣本，它們的相似系數顯著大于不同類別的樣本。
圖4.所有校正樣本與各組平均光譜的相似系數分布。(虛線所示為對應平均光譜同類樣本的相似系數分布下限值，α=0.05)。
圖4所示為所有校正樣本與相應參照光譜的相似系數分布。可以看出，各個生黃連樣本與生黃連平均光譜的相似系數顯著大于另外兩組樣本(圖4.a)，類似的結論對另外兩組樣本也同樣成立(圖4.b和c)。使用該模型對驗證樣本的歸屬進行判斷，可以得到完全正確的分類識別結果。
生黃連和炮制黃連的聚類分析(SIMCA)
SIMCA 算法使用基于主成分分析(PCA)的模型對樣本進行聚類分析，同類樣本分布在主成分空間中鄰近的位置，而不同類的樣本間距離則較遠。圖5所示為所有校正樣本在主成分空間的分布，三類樣本各自聚集成組。使用該模型對驗證樣本的歸屬進行判斷，也可以得到完全正確的分類識別結果。
圖5.所有校正樣本在主成分空間的分布圖。
生黃連和炮制黃連的AssureID軟件分析
在合理的校正模型建立之后，可以使用 AssureID 軟件中的Analyzer 模塊建立一個完整的標準工作流程，逐步指導分析測試人員完成樣本前處理、儀器參數設置、樣本光譜測試、結果分析與報告等整個分析流程，實現分析過程的規范化和標準化。
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小結
本文使用紅外光譜與聚類分析對三種炮制黃連進行了準確地鑒別。傅里葉變換紅外光譜與 ATR附件技術相結合，可以提供簡單快速的樣本測試方法。AssureID 軟件可以建立聚類分析模型對不同種類的樣本進行識別，并且可以建立相應的完整的標準化工作流程。硬件和軟件技術相結合，為中藥的快速質量控制提供了規范有效的方法。
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技術原理
