金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測方法介紹--酶聯免疫法

酶聯免疫法

測定原理:酶標抗體與腸毒素特異結合,加入底物后發生顯色反應。

(1)試劑

①腸毒素酶聯免疫檢測試劑盒。

②洗液:在一個塑料洗瓶內,用 1L 蒸餾水或去離子水稀釋濃洗液(試劑1號)。

③樣品添加劑:試劑2號。

④陽性對照:使用前,試劑3號與洗液按1:100稀釋,稀釋時必須用聚丙烯塑料管。

⑤陰性對照:試劑4號。

⑥結合劑:吸取5mL結合劑稀釋劑(試劑5號)于結合劑(試劑6號)的小瓶內,于室溫下緩慢混合。然后再將6號小瓶的試劑倒入5號小瓶內緩慢混合。

⑦底物:把底物稀釋劑(試劑7號)加入底物(試劑8號)內,在室溫下完全溶解。

⑧終止液:試劑9號。

⑨2%次氯酸鈉。

⑩0.25mol/L PH8.0三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液:稱取 Tris 30.28g,加 800mL 蒸餾水使其完全溶解。加 6mol/L HC1 30mL混勻、調PH8.0,定容1L。

?尿素。

?聚乙二醇(PEG,MW20000)。

(2)設備和材料

①均質器及均質杯(250mL)。

②離心機及離心杯(250mL)。

③磁力攪拌器。

④聚丙烯三角燒瓶(250mL)。

⑤聚丙烯離心管(10mL)。

⑥透析袋(MW12000～14000)。

⑦微量加樣器(1～200μL可調節)。

⑧注射器(5mL)。

⑨塑料洗瓶。

⑩脫脂棉。

?培養箱。

(3)操作步驟

①稱取蘑菇罐頭中的湯和固形物各5g,置于均質杯中,加入0.25mol/L PH8.0的 Tris 緩沖液 100mL,高速均質 3min。

②均質后的混合物轉入離心杯中,以 4500r/min 離心 30min。

③上清液倒入一容器內,待做尿素處理用。

④尿素處理:量取 100mL 上清液,加入 6g 尿素,在聚丙烯三角瓶中混勻,在磁力攪拌器上,25℃緩慢攪拌4～5h。

⑤處理后的樣品液,裝入透析袋內,包埋于 PEG 中,4℃濃縮過夜。

⑥用自來水徹底沖洗透析袋表面的 PEG。

⑦將洗凈后的透析袋浸入 0.25mol/L PH8.0的 Tris 緩沖液中平衡 5min,樣品量不足5mL的可加入 Tris 液補足至 5mL。

⑧將樣品液移入 10mL 離心管中,3500～4000r/min 離心 10min。

⑨準備 1 支 5mL 注射器,加 0.5 cm 厚的脫脂棉并用 5 mL 蒸餾水擠壓緊。

⑩離心后的上清液用帶脫脂棉的注射器過濾。

?測定濾液 PH 值,并根據具體情況用1mol/L NaOH或1mol/L HCl 調 PH 值為7～8。

?在樣品液中加入 100μL 樣品添加劑(試劑 2 號),混勻,待做 ELISA 試驗。

(4)檢測

①從4℃冰箱中取出試劑盒放至室溫,將小孔插入可拼裝式酶標板的托盤,每一個孔做一個樣品,同時再用兩個孔分別做陽性對照和陰性對照。

②在每孔中加滿洗液,20～25℃浸泡10min。

③棄去洗液,翻轉托盤,倒扣在濾紙上以吸干殘留的洗液。

④每孔加入 200μL 的樣品,同時在陽性對照孔中加 200μL 陽性對照物,在陰性對照孔中加入 200μL 陰性對照物(試劑4號)。在樣品記錄表上記下每一樣品的情況,加蓋,37℃溫育 2h。

⑤取出酶標板,按下列步驟對每一孔用洗液重復洗滌3次。迅速翻轉酶標板,將內容物倒入盛有2%的次氯酸鈉溶液的水槽內。將酶標板倒扣在濾紙上,以吸干殘留的液體。每孔加滿洗液。

⑥每孔中加入 200μL 的結合劑(試劑6號),加蓋,20～25℃,1h。

⑦按照⑤方法重復洗滌 5 次,翻轉酶標板,倒扣于濾紙上以吸干殘留的液體。

⑧每孔中加入 200 μL 的底物(試劑8號),加蓋,20～25℃,30～45min。

⑨每孔中加入 20 μL 終止液(試劑9號),混勻,對照比色卡觀察試驗結果,也可用酶標儀測定每一孔的吸光度,并做好記錄。

(5)結果判定

①陽性對照應顯示為深綠色,且吸光度大于1.0,表明所有試劑有效。

②達到下列標準的樣品被判為陽性。陰性對照在比色卡的陰性范圍內,吸光度小于0.2;樣品的顯色深于或相同于比色卡上陽性范圍的顏色,或吸光度大于0.2。

③達到下列標準的樣品被判為陰性。陰性對照在比色卡陰性范圍內,吸光度小于0.2樣品的顯色在比色卡的陰性范圍內或吸光度小于0.2。

④使用酶標儀,在414nm±10nm 波長可讀取樣品的吸光度。雙波長讀數儀用空氣調零點,第二參考波長應指在490nm±10nm。

⑤若陰性對照的吸光度大于0.2,有可能是酶標板未洗凈,該試驗應重復。

⑥為避免因非特異性反應導致結果出現假陽性,當對樣品陽性結果有懷疑時,可用正常兔血清按1:1的比例與樣品在37℃下作用1h后,重復上述試驗。