如何設計PCR引物（一）
“如何設計PCR引物”看到這個題目后肯定有問“什么是PCR”的。對于這個問題，連小白都知道，您不知道，就只好去找百度哥咯。雖然百度哥肚子里其他的信息亂七八糟的，但是這個問題的答案還是蠻統一的，不會有誤導性，但問無妨。另外，也可以看看下圖老外給的簡介，英文不好請有道。
跟“服裝設計”類似，設計PCR引物也需要工具的。因此，在做設計之前，先翻翻自己的電腦是否有“primer premier”或者“Oligo“之類的引物設計專用軟件。當然，這些軟件都是破解版的。說到這，先喊下口號“支持正版，打擊盜版！”。如果您恰巧沒有，也不用急，請留下郵箱地址，我會悄悄發送給你。做PCR無非兩種目的：一是用于病原體檢測；二是用于生
物學研究，如克隆、測序等。根據目的不同，PCR引物設計的流程略有不同。
首先來講講如何設計PCR引物用于病原體檢測，這也是分子診斷常涉及的問題之一。對病原體的檢測，保證檢測特異性是關鍵。因此，在做設計之前，先得找特異性核酸序列。這些序列要相對保守，即突變率低。如小白要做的逆轉錄PCR——一類以RNA為目的序列的PCR，就得找RNA對應的cDNA（互補DNA，可問百度哥）保守序列來做引物設計。類似地，找保守序列也要用工具的，熊哥常用“Vector NTI Advance”里的“AlignX"模塊。當然，您也可以選擇相對簡單的DNAman軟件來做比對。如果您恰巧還是沒有這個軟件，沒關系，請留下郵箱地址吧。好了，下面開始第一個手把手演示——如何用AlignX來做序列比對。
手把手演示1：用AlignX做序列比對。本次演示以查找手足口病毒EV71的衣殼蛋白VP1基因保守序列為例。
1. 登陸”http://www.ncbi.nlm.nih.gov“網站，選擇“Nucletide”。
2. 在“Nucletide”空白欄里輸入關鍵詞，本實例輸入“Human enterovirus 71 VP1 gene”，然后在右側“Results by taxon”欄里選擇“Enterovirus A71”。
3.你會發現有7174條相關序列。一般系統默認每頁只顯示20條，當然可以設置顯示數為最大的每頁200條。
4.這時可以點擊“Send to”在Choose Destination界面中選擇“Clipboard”會將前500條序列加入Clipboard。
點擊右上角的“Clipboard: 500 items”，就意味著已經選擇了7174條中的500條，而這500條也是最新上傳的核酸序列。
再點擊“Send to”在Choose Destination界面中選擇“File”，在format下選擇"FASTA"，點擊“Create File”，會將前500條序列下載下來。
5.打開“AlignX”，點擊導入數據按鈕，選擇剛才下載下來的FASTA格式文件，即可導入序列。
然后進行序列篩選，剔除那些過短的序列。本例中，完整的VP1基因有八百多bp，故低于八百的全剔除。
全選余下序列，點擊比對按鈕，即可進行比對。
特別說明：如果想讓保守序列更加準確，比對序列的數量越多越好。當然，此時得考慮小白的電腦能不能承受，如果想Note7一樣發生自燃了，不要怪隆地熊哦。哈哈！
比對完后的結果是這樣的：
到此，小白要設計的PCR引物序列其3'大部分序列最好在這些黃色區域內，再也不用擔心漏檢了。當然，要保證特異性，還得進入第二個手把手演示了，如何利用保守序列設計PCR引物并驗證其特異性。
