細胞融合實驗
實驗概要
掌握細胞融合原理、應用融合細胞的方法以及細胞融合率的計算。
實驗原理
細胞融合(Cell fusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學的)使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。人工誘導的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術而發展起來。由于它不僅能產生同種細胞融合，也能產生種間細胞的融合，因此細胞融合技術目前被廣泛應用于細胞生物學和醫學研究的各個領域。細胞融合的誘導物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩定。PEG 的促融機制尚不完全清楚，它可能引起細胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團發生結構重排。
主要試劑
1. 50％PEG(MW4,000)
2. Hanks 液(pH7.4)
主要設備
1. 顯微鏡
2. 離心機
3. 水浴箱
4. 刻度離心管
5. 試管
6. 載玻璃片
7. 蓋玻片
實驗步驟
1. 取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。
2. 稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml 預熱的Hanks 液混勻制成50％的PEG 溶液。放入37℃水浴中待用。
3. 取上述10％的雞紅細胞懸液1ml 放入離心管中，再加入5ml Hanks 液混勻，然后以1,000rpm 離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細胞團塊彈散。
4. 取上述50％PEG 溶液0.5ml，在1 分鐘內滴加到雞紅細胞懸液，邊加邊輕輕搖動混勻。待PEG 全部加入后靜置1 分鐘左右。此全部過程都要求在37℃水浴內進行。
5. 緩慢滴加9ml Hanks 液以終止PEG 的作用，在37℃水浴內靜置5分鐘。
6. 離心棄上清后，取一滴融合后的細胞懸液滴片，加蓋片鏡檢。
7. 結果觀察
在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細胞膜融合在一起，形成一個異核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞。
8. 融合率的計算
在高倍鏡下隨機計數200 個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數除以總細胞核數(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。公式如下：
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