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    原位雜交組織化學實驗要求及步驟

    2021.11.19

    一、基本要求

    1. 組織取材:組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快,所以新鮮組織和培養細胞最好在30 min 內固定。

    2. 固定目的是:

    (1)保持細胞結構;

    (2)最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平;

    (3)使探針易于進入細胞或組織。

    最常用的固定劑是多聚甲醛,與其它醛類固定劑(如戊二醛)不同,多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接,因而不會影響探針穿透入細胞或組織。

    3. 增強組織的通透性和核酸探針的穿透性:

    (1)稀酸處理和酸酐處理:為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合,以降低背景,雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10 min,經乙酸酐處理后,組織蛋白中的堿性基團通過乙酰化而被阻斷。組織和細胞標本亦可用0.2 M HCl處理10 min,稀酸能使堿性蛋白變性,結合蛋白酶消化,容易將堿性蛋白移除。

    (2)去污劑處理:去污劑處理的目的是增加組織的通透性,利于雜交探針進入組織細胞,最常應用的去污劑是Triton X-100。注意:過度的去污劑處理不僅影響組織的形態結構,而且還會引起靶核酸的丟失。

    (3) 蛋白酶處理:蛋白酶消化能使經固定后被遮蔽的靶核酸暴露,以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K),還有鏈霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。

    4. 雜交緩沖液孵育:

    雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2 hr,以阻斷玻片和標本中可能與探針產生非特異性結合的位點,達到減低背景的目的。

    5. 防止污染:

    由于在手指皮膚及實驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,為防止其污染影響實驗結果,在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套,實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤(180℃)以達到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時所用的溶液均需經高壓消毒處理。

    6. 雙鏈DNA探針和靶DNA的變性:

    雜交反應進行時,探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進行雜交(包括檢測RNA時),雙鏈DNA探針在雜交前必須進行變性。探針變性后要立即進行雜交反應,不然解鏈的探針又會重新復性。


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