影響尿液儲存穩定性的常見因素

?尿液檢驗因其獲取簡便、收集無創和可提供大量生理變化發展進程的信息, 被臨床廣泛運用。尿液中存在許多潛在的生物標記物, 包括代謝物質、細胞、蛋白、核酸等。這些生物標記物在檢測藥品的安全性、監測急慢性腎臟疾病和其他泌尿道的生理情況上具有突出的作用。為了發現新的生物標記物以及分析這些生物標記物的特異性和靈敏度, 除了依靠高精密的現代化儀器和技術 (蛋白組學、多肽組學、脂質組學、代謝組學),高質量的樣本更是必不可少。因此, 建立高質量的尿液標本保存體系是開展代謝性疾病、腫瘤等重大疾病轉化醫學研究的重要環節。然而, 溫度、酸堿度等許多因素對尿液中的生物標記物產生一定的影響。我們主要綜述了外界因素對尿液檢測指標的影響情況及環境因素對尿液代謝組和蛋白質組學分析的影響情況。

? ? 一、未添加防腐劑情況下的尿液存儲穩定性

? ? 有報道指出, 通常情況下, 尿液的存儲不應當添加任何防腐劑。大量關于尿液中生物標記物存儲穩定性的研究報道都對無防腐劑添加的尿液進行了實驗研究。結果表明:不同溫度條件下, 各種尿液檢測指標的穩定性有所差異。

? ? 臨床常見的尿液檢測指標有尿肌酐 (creatinine, Cr) 、尿酸 (uric acid, UA) 、白蛋白 (albumin, Alb) 、總蛋白 (total protein, TP) 、尿鉀 (K+)等。大量文獻聚焦于對尿Cr、Alb存儲穩定性的研究。尿Cr是臨床重要檢測指標。Cr存儲的穩定性較好, 在4 ℃或25 ℃環境下, 將Cr存放30 d, 仍能保持穩定, 在55℃環境下2 d內能保持穩定。但Cr存儲的穩定性會受到pH值變化的影響。當pH值在0.5~7范圍內時, 室溫或是4 ℃條件下存放尿液1周, Cr量都沒有顯著變化;當pH=10時, 無論是室溫或是4 ℃條件下, Cr值都有降低。Cr在酸性環境中的穩定性是否優于堿性環境還有待于進一步研究。尿Alb是另一個與腎臟、心血管、糖尿病并發癥等疾病相關的檢測指標。在4 ℃或是20 ℃條件下若要保持尿液中的Alb濃度無顯著變化, 存儲天數相對較短, 最長只能存放1周。另有許多蛋白質會受存儲條件的影響, 如半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (cystatin C, Cys C) 、腎損傷分子-1 (kidney injury molecule1, KIM-1) 、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白 (neutrophil gelatinase associated lipocalin, NGAL) 等。Cys C是一種低相對分子質量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。當Cys C/Cr比率在正常范圍時, 尿Cys C濃度對于評價腎小球濾過率有重要價值。Cys C作為常規的生化參數, 在大多數存儲條件下能保持穩定。室溫下48 h內Cys C可以保持穩定, 4 ℃條件下1周內保持穩定。KIM-1作為尿液中的生物標記物對于早期腎損傷診斷具有重要意義。當KIM-1儲存于4 ℃或室溫下, 24 h內不會造成明顯降解。NGAL在腎損傷的早期診斷中也具有重要意義。4 ℃環境下儲存7 d, 蛋白濃度的改變＜2％。此外, 尿糖也是臨床常用的檢測指標。研究表明在4 ℃條件下24 h內尿糖能保持穩定。綜上所述, 室溫或是4 ℃條件下尿液不宜存放過久。

? ? 相較于室溫或是4 ℃條件下的存儲, 尿液中多數生物標記物在低溫凍存狀態下能保持更長久的穩定。在－20 ℃冰凍狀態下, Cr在6個月內可保持穩定,KIM-1存儲12周也不會發生明顯降解,尿Cys C在1周內能保持穩定,尿κ輕鏈、尿λ輕鏈、血清類黏蛋白的量24個月內沒有顯著的改變。轉鐵蛋白、α1微球蛋白在-20 ℃存放4周后濃度開始有明顯變化。但NGAL在-20 ℃存儲時, 其濃度會產生明顯變化。此外, Alb在-20 ℃條件下存儲的穩定性仍是一個有爭議的問題。一方面有多個報道指出:在-20 ℃條件下, Alb能長期保持穩定。如Innanen等指出尿液存儲在-20 ℃條件下3周, 融化后離心前進行震蕩 (倒置3~4下),則尿微量白蛋白 (microalbumin, mAlb) 濃度與凍存前保持一致。還有一些研究表明尿液在-20 ℃凍存1、2及1、2、4、5、6個月, Alb濃度前后差異無統計學意義(P>0.05)。另一方面有研究證實:在-20 ℃條件下, Alb不能保持長期的穩定性。尿液在-20 ℃環境下存放 (161 d、2個月、6個月、12個月或2年),Alb濃度顯著下降。此外, 不同樣品和相對蛋白濃度, 其穩定性也有一定差異。在-20 ℃環境下存儲尿液6個月后, Alb濃度高的尿液其Alb下降率比Alb濃度低的尿液要低。當Alb﹤30 μg/min時,-20 ℃環境下存放2、8、24周, Alb濃度明顯下降;而Alb＞30 μg/min時, 任意儲存溫度、儲存時間都沒有對Alb濃度造成顯著的變化。綜上所述, 凍存導致的Alb聚集 (可以通過震蕩或是倒置來充分混勻樣品, 恢復其原狀) 在一定程度上是造成觀測結果不同的原因所在。是否聚集的Alb會對溶液中的低豐度蛋白起到一個“下沉”的作用, 并不可逆轉地降低其濃度, 至今還沒有定論。Alb存儲穩定性也會受到pH值的影響。存儲前調節pH值＞8.0, 在-20 ℃條件下, 1年內Alb濃度無明顯下降。相反, 若在尿液中添加鹽酸調節pH值至 2.3~2.5時, 會導致室溫下尿Alb迅速降解。可見尿液中Alb的降解具有時間及pH值依賴性。此外, Cys C、KIM-1的穩定性也受到pH值的影響。在pH=5或是更高的情況下, 尿液中的Cys C能保持穩定;雖然pH=4時, Cys C濃度會下降, 但若6 h內將pH值回調到≥5時, 其濃度會回升。當pH值接近中性 (6~8) 時, KIM-1能保持穩定;當pH值呈酸性或堿性時 (4、5、9) 時, KIM-1不再保持穩定。但pH值對尿液電解質的穩定性影響較小。尿液的酸化或是堿化并不改變尿中鈣 (Ca2+)、鎂 (Mg2+)的量。即時測定24 h尿液中的Ca2+、Mg2+、PO43-并不需要添加酸性或是堿性物質[ 33]。考慮到pH值對尿液中多種蛋白質穩定性的影響, 在尿液存儲前應當注意其pH值的大小。

? ? 相比尿液存放于-20 ℃條件下的研究報道,-80 ℃環境下尿液存放的穩定性研究結論比較一致。如Graziani等、Lambers Heerspink等檢測尿樣在-80 ℃環境下保存12個月的變化情況, 發現Alb濃度沒有顯著變化。KIM-1于-80 ℃儲存達2年也不會對其造成明顯降解。Cr在－70 ℃的冰凍狀態下2年內可保持穩定。NGAL在-75 ℃存儲13個月濃度變化不顯著。綜上所述, 若想長期保存尿液, 更適合將其置于深低溫狀態下(-70 ℃或是更冷的溫度) 。不僅由于眾多研究表明尿液于深低溫狀態下凍存時其中的多數生物標記物的濃度變化相對較小, 更有報道指出尿液于-20 ℃凍存后溶解與于-80 ℃凍存后溶解相比, 凍融引起的物質含量下降更為顯著。但尿液中生物標記物也并非都會受凍融的影響造成大幅度地降解。Cys C反復凍融3次后測定其含量為凍融前的97.5%。尿液 (正常Alb尿) 凍存于-30 ℃, 室溫溶解, 反復凍融5次不會對尿Alb/Cr比率造成影響。正常人或是糖尿病患者 (糖尿病患者分為3類:分別為正常Alb尿患者、mAlb患者、Alb尿患者) 尿液凍存在-20 ℃環境下6周反復凍融6次沒有對Alb濃度造成明顯影響。關于Alb凍融的穩定性也有持相反意見的報道。Vangelisti等發現反復凍融尿液會導致Alb濃度進行性下降, 特別是存儲5個月之后濃度變化更為明顯。總而言之, 為了檢測或是研究的準確性, 在臨床工作還是醫學生物研究過程中都應盡量避免反復凍融樣品, 即時檢測其濃度。若需多次使用樣品可以將其進行分裝, 以減少凍融次數。

? ? 近年來, 隨著組學技術的發展, 利用尿液開展代謝組和蛋白質組學分析已日益增多。眾多研究利用蛋白質組學技術分析反復凍融是否會造成蛋白質譜的改變。Papale等運用表面增強激光解析電離飛行時間質譜來觀察室溫下尿液蛋白質譜的變化情況。結果顯示使用蛋白酶抑制劑復合物可增加其穩定性;并且蛋白質譜在凍融前后有微小差異, 但增加凍融次數 (≤5次) 并沒有進一步影響蛋白質譜的改變。Fiedler等使用磁珠來分離尿液中的尿肽然后使用基質輔助激光解吸電離飛行時間技術來描述多肽組的特征, 觀察到凍融1次后尿液和新鮮尿液間蛋白質譜有顯著改變, 但增加凍融次數 (3次內) 不會對蛋白質表達譜造成進一步的改變。另有研究則發現尿蛋白在凍融4次后還能保持穩定;而凍融第5次后這些蛋白就無法被檢測出來。可見, 反復凍融會對尿液蛋白質譜的檢測造成一定影響。

? ? Saude等使用核磁共振氫譜來分析尿液中代謝物質的變化情況。研究結果表明將女性尿液于室溫下存放4周, 若在存儲前將其離心可以降低其中代謝物質的變化程度;若在存儲前過濾尿樣也可以降低其中代謝物質的變化程度, 但相比存儲前離心的尿液其產生的變化程度更大。Erik等將女性尿液在室溫下存放4周, 觀察苯酸鹽和乳酸鹽濃度在原尿和過濾后的尿液中的變化情況。結果顯示原尿中苯酸鹽和乳酸鹽濃度在第一周顯著升高, 在之后的3周升高緩慢;而在過濾后的尿液中苯酸鹽和乳酸鹽濃度在4周內沒有明顯變化。可以看出尿液存儲前的預處理對于尿液存儲過程中的代謝物質變化有顯著影響。而關于存儲條件對尿液中代謝物質的變化情況的研究則表明尿液 (男性尿液、女性尿液) 于室溫下存放4周, 其中的代謝物質有顯著變化;4 ℃條件下存放4周, 代謝物質濃度有輕微降低。

? ? 二、添加不同防腐劑后尿液存儲穩定性

? ? 乙二胺四乙酸 (EDTA) 和亞硫酸氫鈉是常用的尿液采集防腐劑。防腐劑的種類因測試方法、保存時間及樣本運輸條件的不同而不同。當需要保存尿液中的尿膽素原時, 需要添加福爾馬林;但在測定葡萄糖濃度時不能使用福爾馬林, 因其會干擾定性的化學檢測。檢測葡萄糖時可以使用氟化鈉作為防腐劑, 因為其可以阻止糖酵解的發生。可見, 防腐劑對于尿液的常見檢測指標會產生一定的影響, 許多研究也證實了這一現象。將尿液存放于室溫下6 h后可以明顯觀察到加入疊氮化鈉后的抑菌效果。尿液中細菌的繁殖會導致多種生物標記物的降解。將尿液于室溫下存放4周, 若添加防腐劑疊氮化鈉, 隨著濃度的增加 (0.1、1、10 mmol/L),代謝物變化程度變小。Tencer等指出:IgG、HC蛋白在-20 ℃凍存時, 加入防腐劑 (溶液中包括氯化物、EDTA、三羥甲基氨基甲烷、疊氮化物) 能夠阻止其降解。-20 ℃凍存條件下, IgG存儲 1周后濃度開始下降,但加入葡萄糖和牛血清白蛋白后可阻止IgG含量的下降。有文獻顯示, 在尿Alb正常或是有mAlb尿存在的胰島素依賴型糖尿病患者中, 尿中含有葡萄糖的樣本其IgG/Alb指數高于無葡萄糖含量的樣本。推測葡萄糖可能有抑制IgG降解的作用。樣本中加入300 mmol/L葡萄糖可抑制尿液中IgG濃度的下降 (如同時加入牛血清Alb則更佳) 。防腐劑的添加會影響尿液存儲的穩定性, 在選擇防腐劑時應考慮到檢測物質的種類、保存時間等因素。

? ? 三、結語

? ? 總之, 在尿液儲存過程中, 有些生物標記物易受存儲條件的影響, 而有一些分子可以保持較長時間穩定。小分子物質、代謝物質和一些大分子物質之間的穩定性是有區別的。不同生物標記物的降解率是不同的, 而且很難通過生物標記物的分子大小進行預測。尿液中生物標記物受到各種外在因素的影響, 但對一些指標仍存在爭議, 仍有必要開展尿液貯存穩定性的系列研究。