影響免疫濁度分析的因素

免疫濁度分析法包括透射免疫比濁法、散射免疫比濁法、免疫乳膠濁度測定法等。免疫濁度分析由于其反應的特殊性，決定了該方法容易受到抗體性質和質量、抗原抗體的比例以及檢測體系等一系列因素的影響。

1-抗體質量

免疫比濁測定法要求抗體的特異性強、效價高，親和力強。特異性差的抗血清，由于含有大量雜抗體，反應后可形成非特異性濁度 (“偽濁度”)，出現假性升高。使用低效價 (<1:20)抗體會使試劑消耗增多，同時也可增加“偽濁度”的產生。

2-抗體類型

根據抗血清來源的動物種類不同，抗體可分為R型 (rabbit type)和H型 (horse type)。R型抗體親和力較強，與抗原結合后不易解離，在抗體過剩時易形成大而穩定的復合物；但抗原過剩時，則形成可溶性復合物。H型抗體親和力弱，抗原、抗體結合后極易解離，而且抗原或抗體過剩易形成可溶性復合物。R型抗體是用于免疫比濁測定的較為理想的試劑。

小知識

R型 H型抗體的定義

用沉淀反應對不同來源的免疫血清進行比較后，可將抗體按等價帶范圍大小分為兩種類型，即R型抗體和H型抗體。R型抗體的等價帶較寬，具有較大的抗原、抗體合適比例范圍，與相應抗原結合易出現可見的抗原-抗體復合物，僅在抗原過量時，才出現小分子的可溶性抗原-抗體復合物，如兔、羊的免疫血清。H型抗體的等價帶較窄，其抗體與抗原的合適比例范圍較窄，抗原或抗體過量，均可形成可溶性免疫復合物，如馬、人的免疫血清。

2-抗原、抗體比例

抗原和抗體的比例是濁度形成的關鍵因素，抗原和抗體必須在一個適當的濃度才會出現最高結合率。當抗原過量時，形成的免疫復合物分子小，而且會發生解離，使濁度下降，光散射減少；當反應液中抗體過量時，免疫復合物的形成隨著抗原量的增加而遞增，光散射的強度也隨之遞增。因此，免疫濁度測定的反應體系中必須始終保持抗體過量，以保證免疫復合物的生成量與濁度的改變一致，這是免疫濁度測定的基本原則。

抗體過量必須適量，因此實驗中掌握抗體的濃度是關鍵。一般原則是事先確定某一被測物的正常值，以高于或低于此正常值的50%作為測定范圍，抗體在此范圍內均應保持過剩。為了減少“偽濁度”的出現，還應對抗原（待測樣品）進行適當的稀釋。

目前全自動免疫濁度測定儀一般具有抗原過量的自動監測功能，并能對含過量抗原的待測樣品進行自動稀釋，重新監測。其設計原理是：

在抗體過量的前提下，待測抗原在反應液中與抗體快速反應形成穩定的小復合物顆粒，產生散射光信號，該信號隨復合物的增加和時間的延長（在抗體過量階段）而動態性增強，形成速率峰值信號。在規定時間內反應介質中的抗體應將待測抗原全部結合，無游離抗原存在，此時再次加入已知的相應抗原，該抗原與剩余游離抗體結合反應形成復合物，可出現第二個速率峰值信號，表明第一次速率峰值信號是由全部待測抗原產生，以此速率峰值計算待測抗原的量。如再次加入已知相應后不出現第二速率峰值信號，說明反應介質中已無游離抗體存在，第一速率峰值信號是由于部分待測抗原產生，其測定結果有不準確因素，提示應將待測樣本進一步稀釋，重新進行檢測，以獲取全部抗原的真實濃度，保證檢測的準確性。

3-反應的條件

抗原、抗體反應液的最適PH值為6.5~8.5，超過此限度則不易形成復合物，甚至可引起復合物解離。在一定范圍內，離子強度大，復合物形成快；離子強度過低或無電解質存在，則不易出現可見的沉淀反應。離子的種類也可影響免疫復合物的形成，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫濁度法的反應液。

4-增濁劑的作用

在反應體系中加入某些非離子型親水劑，如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）、吐溫 – 20 （Tween – 20）等，可以促進抗原 – 抗體復合物的形成，增加反應速度，其中以PEG8000（一般為MW6000 ~ MW8000）為最常用。增濁劑（亦稱促聚劑）的作用是消除蛋白質（抗原、抗體）分子周圍的電子云和水化層，促進特異性的抗原、抗體分子靠近并結合形成大分子復合物。反應體系中加入適量的增濁劑，在終點法可以縮短反應時間，速率法可以增加反應峰值。PEG的用量為3% ~ 4%，濃度過高易引起血清中其他蛋白質非特異性沉淀，形成“偽濁度”，影響準確性。

5-標本的因素

高血脂（尤其含有乳糜微粒和其他大分子）標本會較強地引起非特異性光散射，使測定值假性升高。此外，疏水巨球蛋白、內源性免疫復合物、單克隆丙球蛋白由于在PEG作用下可發生凝聚，也可影響測定結果。因此，高渾濁標本不能用于檢測。