真核生物 18S 基因核酸檢測試劑盒使用說明
◆?產品說明
物種鑒定系列可針對食品、飼料等樣品中動物源性成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲
線判定結果。本產品用于真核生物的檢測，檢出限為?0.1%。
◆?產品組成（48?測試）
021092M | |
試劑 | 含量 |
A-18S-P | 1000μL ×1 支 |
NG-P | 100μL ×1 支 |
PG-18S-P | 100μL ×1 支 |
◆?適用儀器
熒光 PCR?儀（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等 PCR?擴增儀。
◆?自備耗材和儀器
①滅菌 1.5mL?或 2.0mL?離心管；②滅菌 0.2mL PCR?管或八聯管；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴。
◆?注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：試劑準備區。
2）第二區：樣本制備區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★?分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗產生的所有廢棄物及時處理。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30 秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆?樣品處理
參照《SN/T 3730-2013?食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法》或其他標準處理樣品，制備的樣本保存待用。樣品的采集和制備是動物源性鑒別的重要步驟，為防止交叉污染，應使用一次性消耗品，研缽應經 160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。
取樣應盡量采取肌肉組織，對于同一批樣品，應多點采集合并后，作為一份樣品進行均質，提取 DNA。
采樣過程應快速完成，將采取的樣品迅速放入組織攪碎機中進行均質成糜狀，充分混勻，取 0.1 g?充分混勻的樣品，采用液氮研磨或均質器均質。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆?實驗操作
將試劑完全解凍，各組分離心 30s。
1.試劑配制（試劑準備區，放置于冰盒中進行）：
若有 N?個待檢樣品，則參照下表，按照 N+2?個數量計算反應液用量（N?個待檢樣品+1?個陰性對照+1?個陽性對照），渦旋混勻，離心 30s，分裝于 0.2mL PCR?管中。
試劑 | 使用量 |
A-18S-P | 20×(N+2)μL |
反應液總體積 | 20×(N+2)μL |
2．模板制備（樣本制備區）
建議使用試劑配套動物源性成分 DNA?提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。
3．添加模板（樣本制備區，放置于冰盒中進行）
在步驟 1?中已含有反應液的 PCR?管中加入 5μL?模板，順序為 NG-P、待測樣品模板、PG-18S-P。渦旋混勻 30s，離心 1min，立即進行 PCR?擴增反應。
擴增反應（擴增及產物檢測區）
使用熒光定量 PCR?儀，熒光基團選擇 FAM，淬滅基團選擇 TAMRA。按下列條件設置擴增反應：
PCR 循環 | 熒光收集位點 | |||||||
95℃ | 10 分鐘 | 1 個循環 | — | |||||
95℃ | 15 秒 | 40 個循環 | — | |||||
60℃ | 1 分鐘 | ※ | ||||||
5.基線和閾值設定基線調整取 3-15?個循環的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點
◆?結果判定
檢測樣品無 Ct?值，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有真核生物或含量低于檢測限；
檢測樣品 Ct≤35，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有真核生物；檢測樣品 Ct＞35，可直接報告樣品陰性，不含有真核生物或含量低于檢測限。
NG 反應為平滑直線，PG 反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
