orflab和N基因數值多少是正常
文 | 呂蒙
【核酸的基本知識】
新冠肺炎疫情暴發以來，“核酸”的大名“如雷貫耳”、老幼皆知，到底什么是核酸呢？
核酸就是脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的總稱，是遺傳信息的攜帶者。簡而言之就是個生命體最核心最特異的物質，由于核酸的唯一性，因此可以用來區分鑒別某種病毒的存在，核酸檢測作為目前診斷新冠肺炎的“金標準”。
新冠肺炎的診斷手段有多種，病史、臨床癥狀、影像學檢查，但是都不具有唯一性，唯有“核酸檢測”可以做到。
下面是國家衛健委對新冠肺炎診斷的說明，見于《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版修訂版）》
診斷原則
根據流行病學史、臨床表現、實驗室檢查等進行綜合分析，作出診斷。新型冠狀病毒核酸檢測陽性為確診的首要標準。未接種新型冠狀病毒疫苗者新型冠狀病毒特異性抗體檢測可作為診斷的參考依據。接種新型冠狀病毒疫苗者和既往感染新型冠狀病毒者，原則上抗體不作為診斷依據。
診斷標準
疑似病例具備以下病原學或血清學證據之一者:
（1）新型冠狀病毒核酸檢測陽性；
（2）未接種新型冠狀病毒疫苗者新型冠狀病毒特異性IgM 抗體和IgG 抗體均為陽性。
【核酸檢測的基本知識】
隨著疫情的需要越來越多的檢驗人加入核酸檢測隊伍，雖然做過培訓，但是很多人僅僅會簡單的操作，而對核酸檢測的原理和PCR儀知識的了解很缺乏，下文筆者嘗試從最基礎的知識談起。
熒光PCR法（第二代PCR技術）是病毒檢測的主流方法，也是目前我國新冠病毒檢測采用最多的技術，其中實時熒光定量PCR法最常用。
上面幾張圖是實時熒光定量PCR儀的操作界面，其中可以看到FAM通道，VIC通道，CY5通道，N基因，ORF1ab基因，內標基因，Ct值這些名詞，這些又是是什么意思呢？相互之間又有什么聯系呢？
下面用一個表格來簡單說一下
N 基因和ORF1ab基因
都是特異性基因，不會跟其他病原體重疊。設計時候，兩個基因的序列不一樣，導致靈敏度不一樣，N基因的敏感性比ORF1ab基因高，但是特異性不如ORF1ab基因。
Ct值
（Cyclethreshold，循環、閾值的英文縮寫）其含義是:在PCR循環過程中，每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。
看下面圖示
內標基因
也稱管家基因，通常選擇在生物體各類細胞都能表達的基因，用于流程質控，但它的高表達性，也不能保證采樣的準確性，想要采集合格的鼻咽試子還得規范的操作規程和技術規范。只有高質量的標本，內標基因才能發揮其流程質控的作用。
【結果分析】
01
ORF1ab基因（+）和N基因（+）雙陽性：
如果有新冠肺炎癥狀，可報告“檢出”；
如果臨床癥狀不支持，建議用其他試劑復檢，仍陽性報“檢出”；
否則，考慮假陽性可能。
上圖為ORF1ab基因和N基因雙陽性，內標基因陽性
02
ORF1ab基因（+） 或者N基因（+）單陽性：
建議重新采樣檢測
如果該基因仍陽性且臨床癥狀支持，可報告“檢出”；
如果臨床癥狀不支持，建議用其他試劑復檢，仍陽性報“檢出”；
否則，考慮假陽性可能。
上圖為ORF1ab基因或N基因單陽性，內標基因陽性
03
ORF1ab基因（-） 和N基因（-）雙陰性：
核酸檢測結果為陰性，但是也存在假陰性的可能。
上圖為ORF1ab基因和N基因雙陰性，內標基因陽性
04
內標基因（-）：
采樣不合格，需要重新采樣檢測。
上圖為ORF1ab基因、N基因、內標基因都是陰性。
【核酸檢測的“不靠譜”】
核酸檢測是確診新冠肺炎的“金標準”，但是經常會看到這樣的新聞：核酸檢測了十幾次才確診陽性，還有剛開始檢測為陽性，再進一步檢查為陰性，為什么所謂的“金標準”還那么不靠譜？
所謂“金標準”是指當前臨床醫學界公認的診斷疾病的最可靠方法，可以正確的區分“有病”或“無病”。但不是100%，受人為的主觀因素、客觀因素的影響，比如核酸檢測，核酸采樣的不標準，病毒載量低等。
（一）假陽性
什么是假陽性？是指因為種種原因把不具備陽性癥狀的人檢測出陽性的結果。
1、實驗中陰性對照、空白對照出現了“翹尾”現象，甚至是明顯的“陽性”擴增曲線。(實驗室污染的可能性大)
上圖可見陰性對照實驗也出現了ORF1ab基因和N基因陽性
上圖可見空白對照出現了翹尾現象
2、標本檢測為陽性，但是流行病學史和臨床癥狀不支持新冠的診斷，再次檢測或多次檢測結果均為陰性。(可能存在標本被污染或者或者標本順序被弄混）
什么原因會導致新冠肺炎核酸檢測假陽性？
1、實驗室結構的問題。
2、操作程序不嚴謹，將擴增產物帶入樣本制備及加樣區域。
3、生物安全柜可能會存在核酸污染。
4、疫苗引起的“假陽性”。
如何應對實驗室檢測的“假陽性”？
1、優化實驗室結構
嚴把實驗室工程建設質量關，杜絕分區之間漏氣的情況。時常檢查實驗室傳遞窗及周圍，兩分區之間互通的墻壁插座，墻壁、地面等部位是否存在縫隙，及時妥善封閉。
經常觀察各區的壓力表、計算各區之間的壓差是否在正常范圍之內，如發現異常及時處理。擴增區對完成的PCR反應管密閉丟棄在醫療垃圾桶，嚴禁開蓋。
比較理想的結構是在獨立于PCR實驗室的二級生物安全實驗室進行核酸提取及加樣，然后將加樣的反應體系轉運至擴增室進行下一步的實驗。這樣既可以避免擴增產物對樣本制備過程的污染，也可以避免樣本制備區泄漏的生物安全風險。
2、嚴格按照PCR分區操作，各分區的防護服、手套、消毒噴壺、離心機、加樣槍等堅決不能混用，特別要注意一些清潔用品，如拖把、抹布等更是不能混用。
3、在生物安全柜加樣操作時待檢樣本核酸產物和陽性質控品可放在不同區域進行操作，陽性質控品加樣可不在生物安全柜內操作。若生物安全柜發生核酸污染，則需要更換高效過濾器，或使用可靠的核酸清除降解試劑進行處理。
4、新冠疫苗接種點要遠離采樣點；新冠疫苗接種人員和采樣工作人員堅決不能兼職操作；在接種工作臺面上鋪一次性無紡布，定期清理；按壓的棉簽不要帶走，按醫療廢物在接種點統一收集處理；發生安瓿破裂等現象及時處理，防止污染擴散；醫療機構環境監測避免在接種點采樣檢測。
（二）假陰性
什么是假陰性？就是指某項檢查的結果實際應該是陽性，但由于操作、儀器、個人身體特性等原因導致結果呈陰性。
重復檢測多次陰性后出現陽性結果、咽拭子標本多次檢測陰性但最后在呼吸道灌洗液標本中檢測出陽性結果、核酸檢測陰性但CT影像篩查出現新型冠狀病毒肺炎特征。
實際應該是陽性的標本，檢測卻是陰性。
什么原因會導致新冠肺炎核酸檢測假陰性？
0 1
病毒載量低的問題
采樣時期的影響：感染初期、患者逐漸康復后、間歇性排毒患自身攜帶病毒載量較低，可能造成檢測“假陰性”。
采樣部位的影響：肺泡灌洗液、深部痰＞鼻拭子＞咽拭子 采樣深度、力度均影響病毒載量。
0 2
檢測試劑的問題
核酸提取的效率與純度，體外診斷試劑靈敏度差異，病毒變異性等因素。
0 3
其他問題
操作不夠規范，臨床實驗室不夠規范等。
如何應對實驗室檢測的“假陰性”
0 1
患者病程
不同病程期間，患者機體中的病毒載量不同。例如感染初期，患者自身攜帶病毒載量較低，可能造成檢測“假陰性”。
患者逐漸康復后，病毒載量也逐步降低，此時核酸檢測陽性率隨之下降。面對這種情況，建議在不同時期進行多次核酸檢測，對重點人群進行定期核酸檢測，并做好臨床觀察與數據總結。
0 2
采樣部位
采集肺泡灌洗液、深部痰優于鼻咽拭子，采集鼻拭子優于口咽拭子。 為保證結果準確性，建議采用鼻咽+口咽拭子的方法，即同時采集鼻咽及口咽拭子進行檢測。
0 3
采樣準確性
采樣深度、力度要夠，鼻咽、口咽拭子采集，均需取到較深部的上皮細胞，才可能能夠檢測到病毒存在。
0 4
檢測試劑盒質量差異
現如今檢測試劑盒的質量存在一定的差異。隨著共同的努力和技術的不斷優化進步，會逐漸的改善。因試劑問題造成的假陰性或者假陽性，可以換不用批號或廠家的試劑做對比檢測。
05
其他方法
疑似病例新冠病毒核酸檢測陰性者，可進行IgM抗體檢測，作為補充診斷的指標。 (新冠病毒IgG抗體檢測也用于判斷是否曾經被感染)
END
