• <li id="ccaac"></li>
  • <table id="ccaac"><rt id="ccaac"></rt></table>
  • <td id="ccaac"></td>
  • <td id="ccaac"></td>
    • 氣相 液相 離子色譜 氣質 液質 SPE 紅外 紫外 拉曼 近紅外 ASS OES AFS ICP-MS 微波 電鏡 天平 純水設備 測序儀 移液工作站 COD 粒度儀
    關注公眾號

    關注公眾號

    手機掃碼查看

    手機查看

    喜歡作者

    打賞方式

    微信支付微信支付
    支付寶支付支付寶支付
    ×
    頭像

    分析測試百科網 > 行業資訊 > 技術原理

    動物細胞與胚胎工程實驗常用培養液配制與檢測實驗

    2019.4.09

    動物細胞與胚胎工程實驗常用培養液配制與檢測，可用于（1）動物細胞的培養（2）胚胎工程的發展（3）分子生物學的研究。

    溶液配制法

    實驗方法原理

    動物細胞工程的主要操作對象是離體條件下動物有機體的各部分組織、器官或細胞，這些用來進行離體培養的組織或器官稱為外植體；動物胚胎工程的主要操作對象是配子和胚胎。要滿足操作對象在離體條件下正常生存和生長發育，就必須為其提供適宜生長發育的良好營養條件，即培養液條件。動物的組織、細胞或配子、胚胎在營養代謝、生長發育等多方面相比較，存在著諸多差異，營養需求也不盡相同。所以在進行動物組織、細胞及配子、胚胎的離體操作或培養時，需要配制不同的操作液或培養液。因此，了解培養液的組成與掌握其配制方法是細胞與胚胎工程研究與實驗的一項基本任務。由于動物細胞與胚胎工程操作對象的特點，常用操作液及培養液一般配制為液體狀態。操作液及培養液中一些成分在溶液中不穩定，配制時一般先將液體的最基本成分配成基礎液，使用前將這些成分作為添加成分加入基礎液最終配制成操作液及培養液，不同的培養液及不同的實驗室在添加這些成分時采用的方式有所不同。

    動物細胞與胚胎工程的操作是基于無菌條件下進行的，需要建立一套滿足無菌操作技術和無菌培養的環境，配制無菌的液體為最基本的條件。而液體在制備過程中往往帶有各種雜菌，配制成液體后應立即滅菌，或在24小時內完成滅菌工序。由于動物細胞與胚胎工程操作液和培養液組成成分中常含有遇熱易分解的物質，所以多采用過濾方法除去操作液和培養液中的細菌，并在過濾除菌時完成分裝。為了檢驗配制的液體是否仍有細菌污染，配制成的液體應間隔一定時間進行檢查，如顏色是否變化、是否發生渾濁以及是否有菌落出現等，如有必要可進行培養檢查。

    試劑、試劑盒

    酒精蒸餾水NaOHHCl

    儀器、耗材

    超凈工作臺、酒精棉球酒精噴壺洗滌劑水桶瓶刷試管刷超聲波清洗儀控水架干燥箱電爐高壓蒸汽滅菌器鼓風干燥箱紗布棉布牛皮紙硫酸紙棉繩鋁盒酒精燈酒精棉球精密電子天平藥匙稱量紙燒杯玻璃棒吸水紙滴瓶滴管量筒注射器移液器漏斗容量瓶磁力攪拌器酸度計pH試紙針頭濾器濾膜青霉素瓶血清瓶瓶塞封口膜

    實驗步驟

    一、液體配制的準備


    1．儀器設備的檢查調試


    液體配制涉及的儀器設備，如高壓蒸汽滅菌器、鼓風干燥箱、精密電子天平、超凈工作臺等，在使用前按照說明書，在工作狀態下進行檢查、調試。


    2．物品洗滌及消毒滅菌


    按照第二部分介紹的清洗程序，將與液體及其成分接觸的物品清洗干凈、蒸餾水漂洗后，60 ℃烘干。用于藥品試劑溶解、混合、定容的器皿即可使用。用于液體無菌處理和分裝的器皿及物品進行包裝，耐高溫的器皿及物品采用恒溫鼓風干燥箱進行干熱滅菌；不耐高溫的物品采用高壓蒸汽滅菌器進行濕熱滅菌，濕熱滅菌的物品應再烘干。


    二、常用操作液及培養液的配制


    以實驗指導實驗項目中常用的操作液和培養液為例，介紹液體配制方法。


    1．無Ca2+、無Mg2+磷酸鹽緩沖液[PBS(-)]


    無Ca2+、無Mg2+磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)常用作細胞培養的操作液。配制方法為，稱量NaCl 10.0 g，KCl 0.25 g，Na2HPO4·12H2O 1.44 g，KH2PO4?0.25 g，四蒸水500 mL，燒杯內磁力攪拌充分溶解，1000 mL容量瓶定容，分裝，15磅高壓蒸汽滅菌30 min，4 ℃冰箱保存。


    2．0.25％胰蛋白酶細胞消化液


    胰蛋白酶0.25 g，EDTA0.04 g，PBS(-)液100 mL，燒杯內磁力攪拌充分溶解，0.22 um濾膜正壓過濾，4mL/瓶分裝，-20 ℃冰箱保存。


    3．DMEM細胞培養液


    DMEM液(Dulbicco's minimal essential medium)主要用于細胞培養。稱量高糖DMEM粉13.4 g，NaHCO3?3.7 g，分別加四蒸水300 mL，磁力攪拌充分溶解，再將NaHCO3溶液緩慢加入DMEM液中，1000 mL容量瓶定容，調pH7.2，加血清 110 mL，80單位/mL青霉素，100單位/mL鏈霉素，0.22um濾膜正壓過濾，分裝，4 ℃冰箱保存。


    4．改良杜氏磷酸鹽緩沖液（mPBS）


    改良杜氏磷酸鹽緩沖液（modified phoaphate buffer solution, mPBS）常用作胚胎回收的操作液（沖卵液）。


    配制過程：


    （1）分別制備A、B、C三種溶液，三蒸水量加至最終量的80%，置冰箱冷藏室中冷卻后依次混合，可防止沉淀，然后用容量瓶定容至1000mL。為了指示pH值，可加入酚紅，但它不是PBS的成分，一般加1.0%(g·mL-1)溶液1.0mL·L-1。

    （2）用0.2 mol·L-1NaOH或0.2 mol·L-1HCl調整PH至7.1～7.2(如蒸餾水新鮮，稱量準確無誤，配成后PH即為7.1～7.2，不必調整。實際應用時，若pH不準，也可能是蒸餾水、試劑或稱量準確性問題)。使滲透壓穩定在約290毫摩爾滲透壓濃度(mOsm)。

    （3）如試劑含結晶水量與配方不符，應按分子量換算。對易吸潮的試劑，要在配制前烘烤干燥。烘干溫度要查閱化學手冊，以不使試劑分解或損失分子中的結晶水為原則。

    （4）用G6濾器抽濾除菌，或用針頭濾器安裝濾膜后正壓過濾除菌。

    （5）在制備過程中，特別是過濾、分裝時要嚴格遵守無菌操作規程。配制好的液體分裝密封后，標明配制日期。4 ℃冰箱中可保存1～4個月。不可在冰箱冷凍室或低溫冰箱中保存，否則會有鹽類結晶析出。

    （6）臨用前按需要量加入牛血清白蛋白或滅能胎犢血清、新生犢牛血清。一般在沖卵液中加入血清的濃度為2％～5%。為了使用方便，可在過濾前加入血清，然后再過濾分裝。血清滅能可除去血清中的毒胚因子，滅能方法是把血清在56 ℃下維持3O分鐘。


    5．CZB液


    CZB液為Chatot CL,Ziomek CA和Bavister BD于1989年發表的專為克服小鼠胚胎體外培養中2-細胞阻滯的培養液，并以三人的名字縮寫簡稱為CZB液。其基本組成成分見表4-2。其特點是在早期卵裂階段不使用可能導致胚胎發育延遲和發育阻滯的葡萄糖，而使用谷氨酰胺克服小鼠胚胎的2-細胞阻滯。但早期胚胎發育到后期，需要在含5.56 mM濃度葡萄糖的CZB液中培養48 小時，可很好地支持桑椹胚發育到囊胚。近年來，CZB液及其改良液體常被用于小鼠胚胎體外操作和培養的液體。


    6．KSOM液


    KSOM液最早為Lawitts和Biggers(1991,1992)發表的SOM液(Simplex Optimized Medium)，可支持受精卵克服2-細胞阻滯。后來，SOM液的NaCl和KCl濃度被提高后(Lawitts和Biggers 1991，Erbach et al 1994)，新的液體被稱為KSOM。KSOM液培養小鼠胚胎時，有較高的細胞分裂率和較高的囊胚發育率。KSOM液的基本組成成分見表4-3。

    ?


    CZB液及KSOM液的配制方法：用四蒸水或超純水溶解NaCl、KCl、KH2PO4、NaHCO3、乳酸鈉等基本成分及丙酮酸鈉、EDTA、青霉素、鏈霉素等添加成分，共同組成A液；CaCl2和MgSO4.7H2O分別溶解，為B、C液。將三種液體在4 ℃冰箱降溫后混合，以防止沉淀，混合后用蒸餾水定容。之后加入酚紅(1%,mL·mL-1，加入量1000mL·L-1)，觀察顏色并用精密試紙和儀器測定pH值，并用0.2 mol·L-1?HCl或0.2 mol·L-1?NaOH調pH到7.3±0.1。用濾器進行細菌過濾，分裝備用。谷氨酰胺（終濃度一般為1 mmol·L-1，母液1%，每mL加10 mL）、葡萄糖則先配成高濃度的母液，臨用時將母液加入培養液而達到最終濃度；血清或BSA則分成小包裝，在臨用時加入培養液，血清終濃度一般為10～20%(V/V)，BSA終濃度一般為4000 mg·L-1。使用時按所需濃度加入血清、BSA和谷氨酰胺后，用0.22 um的濾膜再次進行細菌過濾。另外需要注意的是，將BSA加入培養液時勿攪拌或劇烈晃動，以免產生大量泡沫，應將所需量BSA撒在液體表面，待其自溶或輕輕晃動溶解。

    ?

    展開?
    注意事項

    1. 動物細胞的培養需要在嚴格無菌的環境下進行。


    2. 氨基酸是組成蛋白質的基本單位，不同的細胞所需要的氨基酸種類不同，要根據不同的培養的細胞，在培養液中加入不同的必須氨基酸。

    其他

    1. 原代細胞：將動物各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA） 或機械方法處理，分散成單細胞，在合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。


    2. 傳代細胞：是所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續生長，這一過程就叫傳代。傳代培養可獲得大量供實驗所需細胞。


    3. 動物細胞培養基按其來源分為合成培養基和天然培養基（目前使用的培養基絕大部分是合成培養基），按其物質狀態分為干粉培養基和液體培養基兩類。

    展開


    互聯網
    推薦
    推薦作者
    熱點排行
    一周推薦
    關閉

    Copyright ?2007-2021 ANTPEDIA, All Rights Reserved

    京ICP備07018254號 京公網安備1101085018 電信與信息服務業務經營許可證：京ICP證110310號

  • <li id="ccaac"></li>
  • <table id="ccaac"><rt id="ccaac"></rt></table>
  • <td id="ccaac"></td>
  • <td id="ccaac"></td>
    • 床戏视频