血清總膽固醇的測定
實驗原理
血清膽固醇(chol)測定是動脈粥樣硬化性疾病防治、臨床診斷和營養研究的重要指標。正常人血清膽固醇含量范圍 100 ~
250mg/mL。膽固醇是環戊烷多氫菲的衍生物,它不僅參與血漿蛋白的組成,而且也是細胞的必要結構成分,還可以轉化成膽汁酸鹽、腎上腺皮質激素和維生素D等。膽固醇在體內以游離膽固醇及膽固醇酯兩種形式存在,統稱總膽固醇。總膽固醇的測定有化學比色法和酶學方法兩類。本實驗采用前一方法。膽固醇及其酯在硫酸作用下與鄰苯二甲醛產生紫紅色物質,此物質在550nm波長處有最大吸收。因此,可用比色法作總膽固醇的定量測定。膽固醇含量在
400mg/100mL以內時,與光吸收值呈良好線性關系。本法不必離心,顏色產物也比較穩定。
試劑和器材
一、試劑
鄰苯二甲醛試劑:稱取鄰苯二甲醛50mg,以無水乙醇溶至50mL冷藏,有效期為一個半月。
混合酸:冰乙酸100mL與濃硫酸100mL混合。
標準膽固醇貯存液(1mg/mL):準確稱取膽固醇100mg,溶于冰乙酸中,定溶至100mL。
標準膽固醇工作液(0.1mg/mL):將上述貯存液以冰乙酸稀釋10倍,即取10mL用冰
乙酸稀釋至100mL。
二、測試樣品
0.1mL人血清以冰乙酸稀釋至4.00mL。
三、器材
試管1.5×15cm(×12);移液管0.5mL(×5),10mL(×1),0.1mL(×1);分光光度計。
操作方法
一、制作標準曲線
取9支試管編號后,按下表順序加入試劑:
管號 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
標準膽固醇工作液(mL) |
0 |
0.05 |
0.10 |
0.15 |
0.20 |
0.25 |
0.30 |
0.35 |
0.40 |
冰乙酸(mL) |
0.40 |
0.35 |
0.30 |
0.25 |
0.20 |
0.15 |
0.10 |
0.05 |
0 |
鄰苯二甲醛試劑(mL) |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
混合酸(mL) |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
相當于未知血清中 總膽固醇量(mg%) |
0 |
50 |
100 |
150 |
200 |
250 |
300 |
350 |
400 |
A550 |
加畢,溫和混勻,20~37℃下靜置10分鐘,在540nm波長處測定光吸收值。以總膽固醇量(mg%)為橫坐標,光吸收值為縱坐標做出標準曲線。
二、樣品測定
取3支試管編號后,分別加入試劑,與標準曲線同時作比色測定:
管號 |
對照 |
樣品 ① |
樣品 ② |
稀釋的未知血清樣品(mL) |
0 |
0.40 |
0.40 |
鄰苯二甲醛試劑(mL) |
0.20 |
0.20 |
0.20 |
冰乙酸(mL) |
0.40 |
0 |
0 |
混合酸(mL) |
4.00 |
4.00 |
4.00 |
A550 |
加畢,溫和混勻,20~37℃下靜置10分鐘,在550nm下測定光吸收值。然后,從標準曲線上可查出樣品中總膽固醇的含量。
注意事項
本法在20~37℃條件下顯色。
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