人外周血淋巴細胞的培養及染色體制片實驗

實驗方法原理 外周血是制備動物染色體標本的重要材料之一,但通常情況下哺乳動物的外周血中是沒有分裂相的,其他動物如兩棲類外周血中也只是偶爾能見到分裂相。外周血中的小淋巴細胞幾乎都處于G1期或G0期,在人工離體培養的培養基中加入植物凝集素(photohemagglutinin,PHA)后,小淋巴細胞受刺激轉化成淋巴母細胞,隨后進入分裂期。這樣,經過短期培養后,用秋水仙素處理,就可獲得大量有絲分裂中期細胞,以用于制備染色體標本。

實驗材料 人外周血淋巴細胞

試劑、試劑盒 RPMI“1640” 培養基小牛血清肝素生理鹽水溶液(500單位 ml)5%NaHCO3秋水仙素(4μg ml)PHA雙抗(青霉素1萬單位 ml、鏈霉素1萬單位 ml)

儀器、耗材 超凈工作臺恒溫培養箱恒溫水浴鍋離心機20ml培養瓶注射器及針頭剪刀及鑷子燒杯及量筒

實驗步驟

1.培養基的分裝:在超凈工作臺內,用量筒取“1640”培養液40ml、血清10ml,用1ml注射器取肝素0.3ml、PHA0.4ml、雙抗0.3ml(終濃度各140單位/ml)。混勻后,用5%NaHCO3調整pH值至7.2。用5ml移液管分裝入20ml培養瓶,每小瓶5ml,蓋緊皮塞,膠布封口備用。如不立即使用可置0℃保藏,用前用37℃水浴處理10min即可。

2.采血:用肥皂洗凈供血者的手,再用2%碘酒、75%酒精擦拭指尖消毒,待酒精完全揮發干之后,用無菌采血針或三棱針刺破指尖,用無菌吸管吸0.3～0.4ml血液移入培養瓶,輕輕搖動,使血與培養基混勻即可培養(或用2ml注射器,7號針頭,先吸取少許肝素溶液潤濕針筒,從肘靜脈采血1～2ml,每個培養瓶接種全血0.3ml左右)。

3.培養:將接好血細胞的培養瓶置37℃溫箱中培養68～72h。

4.秋水仙素處理:培養終止前6～10h加秋水仙素(2μg/ml),用5號針頭加3～4滴,使最終濃度為0.01～0.02g/ml,處理2～4h。

5.低滲處理:由溫箱中取出培養瓶,用吸管吸去上清液,培養物沉積在瓶底,加入約6.5ml經37℃預熱的0.075mol/L KCl溶液吹打均勻,置37℃水浴中低滲處理20min,使紅細胞破碎,白細胞膨脹。

6.離心:以1000r/min離心5min,用吸管吸去全部上清液及沉淀上層較透明的部分(紅細胞碎片),收集白細胞。

7.固定:沿管壁慢慢加入甲醇-冰醋酸(3∶1)固定液5～6ml,吸管吹打均勻,固定20min。1000r/min離心5min,棄上清液。

8.制片:視離心管底細胞多少加入少量新鮮固定液,吹打成均勻懸浮液。取潔凈冰水中預冷的載玻片,稍作傾斜,用吸管吸取一滴上述細胞懸浮液,于載玻片上方適當高度滴在載玻片上,立即吹散吹勻載玻片上細胞,空氣干燥(所得制片可留作顯帶實驗)。

9.染色:載玻片充分干燥后,用pH6.8的磷酸緩沖液按1份Giemsa原液、9份磷酸緩沖液混勻后染色。材料面向上,用染液覆蓋載玻片,染色10～15min,用流水洗去多余染液,再用洗水紙吸干多余水分,干燥后即可鏡檢。

在低倍和中倍鏡下,尋找分散適宜,染色體不重疊,濃縮程度適中,形態清晰的分裂相,并在油鏡下觀察染色體的數目和形態。選擇一有代表性分裂相,用數碼成像系統進行顯微攝影,以供作核型分析之用。

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注意事項

1.接種的血樣越新鮮越好,最好是在采血后24h內進行培養。如不能立即培養,應置于4℃存放,避免保存時間過久,影響細胞活力。

2.在培養中成敗的關鍵點除了PHA的效價很重要外,培養溫度和培養液的酸堿度也十分重要。人外周血淋巴細胞培養最適溫度為37±0.5℃,最適pH值為7.2～7.4。

3.在培養過程中,如發現血樣凝集,可將培養瓶輕輕振蕩,使凝塊散開,然后再放回37℃培養。

4.本實驗采用人外周血微量培養法進行人染色體制片,其他動物可采用相同的方法,只是根據不同對象進行適當的改動。

5.如果細胞膨脹得不夠大,細胞膜沒有破裂,或者染色體不夠分散,可適當延長低滲時間。