植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析
一、目的
?掌握植物基因組DNA提取的一般方法及注意事項。大分子量DNA分子的酶切分析。
?二、原理
?十六烷基三乙基溴化胺是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3
?mol/L
?NaCl)時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
?三、試劑與器材
?（一）、試劑
?1 、DNA extraction ：500ml
? ?31.885g ?sorbitol (山梨醇)
? ?6.05g ? ?tris ? PH8.2 ?(一般不調)
?2、Nuclei lysis buffer: 500ml
? ?100ml ? ? ? 1M ?Tris PH7.5
? ?100ml ? ? ? 0.25M ?EDTA
? ?200ml ? ? ? 5M ? ?NaCl
? ?10g ? ? ? ? CTAB
? ?100ml ? ? ? ddH2O
?3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽) ?500ml
? ? 用時，將上述三種溶液按1：1：0.4 比例混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g/l），65℃預熱，既為抽提液。
?（二）器材
? ? ?恒溫水浴、研缽、電泳設備
?四、操作步驟
?（一）、基因組DNA提取
?1
?取0.15g左右小麥葉片，在液氮中研磨后放入1.5ml離心管中，加入700ml抽體液（65℃預熱）混勻，放入65℃水浴中，裂解40-60分鐘，期間溫和混勻幾次。
?2 取出裂解好的DNA ，加入700ml氯仿：異戊醇（24：1），猛烈混勻，離心（1000rpm，10分鐘）。
?3 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍預冷異丙醇，緩慢混勻后，再猛烈混勻，使DNA成團，-20℃放半小時以上。
?4 將析出的DNA 離心，14000rpm，10分鐘。
?5 去掉上清，將沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，離心 干燥，溶于50ml ddH2O。
?（二）、酶切及電泳分析
? ?取四支1.5ml離心管，分別寫上標記：g/EcoRⅠ（學號）、g/HindⅢ（學號）、λ/EcoRⅠ（學號）和λ/ Hind Ⅲ（學號）。
? ?前兩支試管加入30 ml基因組DNA。后兩支試管加入3mlλ基因組DNA。
? ?前兩支加入5 ml 10×buffer。后兩支加入2ml 10×buffer。
? ?前兩支分別加入ddH2O 12.5ml，后兩支分別加入ddH2O 13ml
? ?分別加入RNase 1 ml。
? ?前兩支試管分別加入1.5 ml ?EcoRⅠ和Hind Ⅲ，10000rpm離心20 S混勻。前兩支試管分別加入1 ml EcoRⅠ和Hind
? ?Ⅲ，10000rpm離心20 S混勻。
? ?37℃反應4h
? ?0.8%瓊脂糖凝膠電泳（樣品全部點樣）。
? ?觀察記錄并分析實驗結果
