臨檢專業的現狀，發展和對策

　　從主任給我一個題目,讓我向大家介紹一下臨床檢方面的進展和談談我們的差距,確定我們今后的努力方向。??

　　我想進展方面有三個，一個是各種自動化檢則儀器的升級和使用一個是檢測標準化的問題:再一個是一些新的檢測項目陸續進入臨床應用。??

　　差距,我和各位主任的想法恐怕是一致的,主要不在技術和儀器本身上,而在工作的管理,特別是操作規范化、標準化、質量保證體系的運行和與臨床的溝通上。??

一、自動化檢測儀器使臨床檢驗工作面貌一新,但也帶來新的問題??

　　這些年來,血球自動化計數儀,尿液分析儀,凝血儀,血沉儀以及各種快速,便捷的試劑條,試驗卡廣泛地應用在門診、病房和急診的常規檢驗工作中,不僅大大地提高了工作效率,縮短了檢驗時間,方便了病人,也減輕了操作人員的勞動強度,使臨檢工作面貌一新。但是,也帶來新的問題。有的工作人員過分地依賴儀器報告的數據,忽視了顯微鏡檢查,造成漏診和誤診,特別是急性白血病、血小板疾病的漏診和誤診率較高。尿液檢查自使用尿分析儀以后,本應當加強對檢測報告的分析把關,必要時一定要進行顯微鏡檢查,并以顯微鏡檢查為準,但是,執行得不認真,也給臨床和病人帶來許多問題。??

　　我們必須清楚,儀器分析的方法學和我們傳統的顯微鏡檢查有根本的區別,兩者目前還有一個很好的對應關系。??

　　比如,血球分析儀從簡單的兩分類,三分類,到現在的五分類儀器,使用得越來越多。當然,五分類儀器由于采用除電阻抗原理外,還吸收了電導,光散射原理,形成所謂的VCS技術甚至有的儀器還應用了射頻技術,細胞化學染色技術,多角度偏振光散射技術。在儀器功能方面,許多儀器都使用了計數周期的控制技術，樣品進樣和防堵孔技術為了保證血細胞計數的準確性,特別是血小板計數的準確性,許多儀器采用了計數周期的控制技術,樣品進樣和防堵孔技術為了保證血細胞計數的準確性,特別是血小板計數的準確性,許多儀器采用了掃流技術,鞘流技術，防返流裝置Von Behrens感應器,延遲計數,浮動界標和擬合曲線等措施。但是,不論生產廠家采取什么樣的技術和措施,儀器如何升級換代,都代替不了人工顯微下對細胞形態的真實觀察。此外,越是高檔次的儀器對標本的要求也就越苛刻。??

　　Sysmex SF-3000是一臺五分類的高檔血球分析儀,它通過分類(DIFF)和白細胞/嗜堿性粒細胞(WBC/BASO)2個測試通道,采用流式細胞儀原理和半導體激光技術進行白細胞分類的,但是儀器仍然有三種提示旗號:（1）Imm Gran(未成熟粒細胞)(2)NRBC/PLTC(有核紅細胞/血小板凝集)(3)Blast/Aty(原始細胞/異常淋巴細胞)。天津市等三中心醫院檢驗科的高潔,許宏敏,盧普美同志、總結了182例儀器檢查有異常提示病例,結果是該儀器對異常細胞檢出的特異性為72.2%,敏感性為98.2%,檢出有效率為80.2%。具體可見表1,2。??
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　　為什么儀器的假陽性率如此高,分析其原因有二:一是儀器設置的警示閥較低,為的是提高儀器的靈敏度,以減少漏診二是與工作條件有關,儀器負荷重,穩定性減低,可使警示閥改變。??

　　即使是目前最先進的Sysmex HST-300全自動血液分析工作站,它是由主機SE-9000,R-3500和SP-100組成,分別采用了電阻、射頻和流式細胞儀等技術,不僅可以對白細胞進行五分類,還可以計數網織紅細胞以及自動推片、染色。但是仍然有自動報警設計,通過IMI(未成熟細胞)來識別幼稚細胞,提高儀器對異常細胞的檢出率,也不能完全取代顯微鏡檢查。??

　　更何況,儀器越先進、高級,對試驗條件的要求也就越高,你稍不注意,報警裝置就會經常給你發出各種警示旗號,弄得你不知道要不要進行人工復查。??

　　因此,做為檢驗科主任必須要求我們的具體操作者,嚴格按照規范化操作程序進行,這些程序必須文件化,寫入實驗室操作手冊,每個人都必須嚴格執行。??

　　又如,尿液分析從尿8項分析儀,發展到尿10項分析儀,為了控制維生素C對尿糖、尿蛋白等檢測的干擾,又推出了尿11項分析儀,這些儀器大家都已經很熟悉了。但是,尿液的干化學檢查僅是尿液檢查的過篩試驗,并不能做為泌尿系統疾病的診斷試驗。??
　　尿沉渣檢查對臨床診斷泌尿系統疾病很重要,但操作起來很麻煩,又不規范,所以,尿沉分析儀也研制開發出來并已經推向市場。美國DiaSys R/S2003尿沉渣定量分析工作站和日本Syemex UF-100尿沉查分析儀就是其代表,國內一些生產廠家也在推出自己國產的尿沉渣分析儀,看來,大有普及的趨勢。上述兩種尿沉渣分析儀的原理不同,各有優點。??

　　例如Syemex UF+100尿沉渣分析儀采用了流式細胞儀和電阻抗原理,根據尿液中不同有形成分的熒光強度,前向角散射光強度和細胞通過產生的電阻抗分別落在不同的區域,打印出紅細胞,白細胞的直方圖和各有形成分的散點圖。DiaSysR/S2003尿沉渣定量分析工作站則完全依靠光學顯微鏡的對有形成分的形態觀察,不僅可將有形成分具體地顯示在顯示器的熒屏上供操作人員分析,而且可以通過一個固定的流動計數室對細胞等有形成分進行定量計數。雖然,這兩種尿沉渣分析儀原理不同,但都克服了操作者主觀性造成的誤差,提高了檢測的精密度和準確度,并使尿沉渣檢查規范化和標準化。但是,是不是有了尿沉渣分析儀,我們就可以完全依靠它,而放棄顯微鏡檢查呢?顯然不能這樣。更何況,儀器不能對白細胞進行分類計數,而尿液中白細胞的分類檢查對臨床診斷感染性疾病和免疫性疾病是非常關鍵的。況且,在這些尿沉渣分析儀沒有普及情況下,目前我們大多數醫院的人工尿沉渣檢查現狀如何?恐怕主任們心中有數。??

　　糞便檢查的現狀也不令人滿意,首先我們國家臨床醫生對糞便檢查的目的性不明確,好象不是很有目的,而是一種常規,有病必查糞便。有人報告,國外住院病人檢查糞便的不足10%,而我們醫院可能高達70%以上。大量無意義的勞動占去我們病房檢驗人員的時間,又如何能把注意力集中在有問題的標本上呢?就我們自身來講,我們又有多少人能準確識別糞便中不同的寄生蟲卵?腸道傳染病發病率始終居高不下,除了痢疾桿菌之外,出血性大腸桿菌O157:H7,成為新的致病菌,危害很大抗生素的大量和不適當的使用,腸道菌群失調性腹瀉發生率逐年增加由于艾滋病的蔓延,隱孢子蟲感染也成為一個重要的臨床問題,這些都對我們糞便微生物的快速檢查,快速診斷提出的新的要求,當然不僅是快速,更應當強調準確。?

　　再如,各種半自動,全自動凝血儀基本上已經完全取代了手工操作,PT試劑也有了ISI值,是不是凝血檢查就不存在問題了?我舉個例子,大家都知道,報告病人PT和APTT結果時,一定要同時報告正常對照的PT和APTT測定值,以便讓臨床醫生判斷患者的PT和APTT的參考范圍固定編進儀器的計算機系統,正常對照不用做了,正常對照不是一個具體數字,而是一個范圍,這符合要求嗎?還有,試劑的ISI在你這個儀器上,有沒有改變,按照試劑的ISI值,計算不同儀器的INR有沒有差異?如果有差異,對臨床口服華法令的監測有何影響?如何解決???

　　此外,計算機圖象識別能力軟件的開發和應用也給我們傳統的顯微鏡檢查帶來新鮮的內容,比如現在市場上正在宣傳的多功能顯微圖象分析系統,除了可以對骨髓細胞進行形態學分析,還可以對染色體,精子進行分析,當然這些分析都是計算機模擬進行的,準確度多在90%左右,但對疑難病例和不典型的形態學變化,仍需要人工檢查。又如,根據細胞核仁區非組蛋白硝酸銀染色原理建立的KL-型腫瘤免疫圖象分析系統以及根據熒光染色和激光照射的原理設計的網織紅細胞自動分析儀等。雖然這些技術本身是建立在顯微鏡檢查的客觀基礎上,但是仍然存在操作規范化或標準化的問題,不同的軟件對細胞分析判斷上也有不同,如何做到一致和標準化???

　　血液流變學檢測義器目前市場上比較混適,各個生產廠家都在竭力宣傳自己的產品,但是國家尚沒有統一的行業標準,只有企業標準,臨床應用中缺乏規范化操作程序,又沒有符合要求的質控物,儀器不能定期進行校準,所有這些問題都使得血液流變學參數的臨床意義大打折扣,很難得到臨床醫生的認同。??

二、檢測過程的規范化和標準化已成為我們面臨的最緊迫的問題??

　　規范化和標準化的含義是不同的,規范化是指某項工作的一致性或稱統一性,大家都按這個程序或步驟去做相同一件工作,大家的工作就有了可比性標準化是指制定一個條件,一個程序,它首先要達到滿足質量要求并可溯源到國際或國內最高標準的,大家都應遵守的一套工作程序。可以說,實現標準化就實現了規范化,但規范化的東西不一定都符合標準化的問題。??

(一)血細胞計數的規范化??

　　1.規范化??

　　(1)采血的部位,抗凝劑的使用,容器的選擇,標本的保存,標本的稀釋:??

　　這里我只提一下測定時間對質量的影響。??

　　EDTA抗凝的末梢血應至少在15分鐘以后進行測定,因為在這段時間內有些標本血小板有暫時的聚集現象,使血小板計數假性減少,這不僅影響血小板其他指標的準確性,也造成紅細胞計數有所增高。取血后立即檢測,標本的血小板和白細胞體積分布直方圖可能是異常的,放置一段時間后在測定就可得到分布正常的直方圖。??

　　(2)試劑的配套使用,特別是溶血劑的正確選擇和使用:??

　　全自動血液分析儀可以控制溶血劑的加入量及溶血劑作用時間。但在使用半自動血細胞計數已進行血細胞計數時,需要在血液予稀釋后人工加入溶血劑,溶血后在進行血細胞計數和分類計數,正確掌握溶血劑用量及溶血時間非常重要。如果加入量不足或加入后放置時間過短,可以造成溶血不完全,使未溶解的紅細胞計如白細胞中,造成白細胞假性增加。溶血不完全也可以使血紅蛋白測定偏低。如果加入溶血計量過多或放置時間太久白細胞明顯變形,使白細胞直方圖異常,白細胞分類計數結果不準確,甚至不能進行分類計數。?
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　　(3)標本自身的干擾因素:??

　　其中血小板計數最容易受干擾,大家都很清楚,血小板計數的范圍(又稱計數閾)是2-24fl,3-20fl為準確計數閾,20-24fl為血小板計數的漂浮閾。小紅細胞體積<24fl,計入血小板,使血小板假性增高巨大血小極和血小板聚集,計入紅細胞,使血小板計數假性減低。??

　　(4)工作環境的監測。??
　　(5)新儀器或新監測系統的性能評價。??
　　(6)儀器的校準。??

　　儀器使用一段時間后,必須進行校準。校準前應徹底清洗管道,去除管道中的殘留血液,吸附的蛋白和纖維等,然后測定試劑空白,本底符合要求(一般要求紅細胞、白細胞,血小板和血紅蛋白四項本底為0)。要檢查標準物是否在有效期內,外觀有無變化。從冰箱取出后,要平衡至室溫,輕輕混勻。在儀器上測定標準物11次,第1次數據不用,從第2次到11次,計算均值,標準差,絕對誤差和相對誤差。判斷標準結果,必須達到標準要求。見表3。??
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　　如果各參數的絕對誤差和相對物產小于一級要求,屬合格,不須做任何校準如果參數大于一級要求,而不小于二級要求,可按儀器說明書要求調整系數。調整后應再測定另一瓶全血校準物,應當達到一級要求。如果結果大于二級要求,則需通知廠家修理和調整,此時儀器應停止使用。??

　　(7)室內質控制措施??
　　(8)室間質評的評估和分析??
　　(9)糾正措施和實施記錄??
　　(10)人工顯微鏡復查的規定。??

　　2.人工顯微鏡復查的規定??

　　中華醫學檢驗學會1995年在武夷山會議上曾就在使用自動化血球計數儀當中進行必要的人工顯微鏡復查提出過一個標準,其中規定凡出現以下情況之一者,都應當進行顯微鏡復查:??

　　(A)血細胞計數結果明顯異常；??
　　(B)血細胞直方圖異常??
　　(C)出現警示旗號。??

　　可是我們很多具體操作人員在日常工作中并沒有嚴格執行,而是想起來就做,想不起來就不做有的異常就做,有的異常就不做,各有各的"標準",這種情況必須加以糾正,統一到規范化規定上來。??

　　(1)有人問,血細胞計數明顯異常如何掌握???
　　可以從兩個方面掌握,一個是試驗允許誤差,一個是醫學決定性水平。??

　　(2)有人問直方圖異常如何掌握???
　　A.紅細胞直方圖比較容易掌握,峰值左移觀察血涂片,是否紅細胞體積偏小(再結合MCH,可分析是否有色素含量減少)峰值左移觀察血涂片,是否紅細胞體積偏大(再結合MCH,可分析是否有色素含量增多)雙峰時,也要觀察血涂片,注意紅細胞的特點。
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　　B.白細胞直方圖也不難掌握,正常情況下三分類血球分析儀打出的是"兩峰一谷":第一個峰,細胞體積范圍是35-98fl,代表占外周白細胞總數20-40%的成熟淋巴細胞第二個峰,細胞體積范圍是150-450fl,代表占外周血臼細胞總數50-75%的嗜中性粒細胞細胞體積范圍98-150fl,代表占外周血白細胞,嗜酸和嗜堿性粒細胞,因三者之和,也僅占外周血白細胞總數的10%左右,相對于成熟淋巴細胞和嗜中性粒細胞來說,比例很小,所在直方圖上只能是個"谷"。如果白細胞直方圖失態,不是"兩峰一谷",而是單獨的一個峰,而這個峰有恰恰位于原來的"谷"的位置上,那是急性非淋巴細胞性白血病的重要特征。如果這個單峰基本位于原來淋巴細胞的位置上,那是急性淋巴細胞性白血病的特征。如果正常的淋巴細胞峰變得很矮小,而原來嗜中性粒細胞變得又寬又高大,那是慢性粒細胞性白血病的特征。這些只要我們做血涂片觀察，我想任何一位檢驗工作者都不會漏診白血病。??
　　C.血小板直方圖的異常比較難掌握,因為血小板直方圖的改變往往是干擾造成的，常見的干擾有小紅細胞,細胞碎片,微小的血凝塊,血小板聚集等。??

　　如小紅細胞增多時,如嚴重的缺鐵性貧血,這些體積小子20fl的小紅細胞就可能進入血小板的計數范圍之中,使血小板計數假性增高。同時，血小板直方圖出現尾部曲線上升的形態。??

　　如細胞碎片,如果碎片大于紅細胞體積界限的低值時,這些碎片會被計數為紅細胞使紅細胞計數假性增高,不會對血小板直方圖產生影響。但如果細胞碎片小于20fl,將被計數為血小板,使血小板計數假性增高。同時,使血小板直方圖前部曲線抬高。??

　　如血小板凝塊,少量小的凝塊不會對血小板直方圖有明顯影響。大的血小板凝塊,體積大于20fl,將被計數為血小板,使血小板計數假性增高。同時,使血小板直方圖前部曲線抬高。??

　　如血小板凝塊,少量小的凝塊不會對血小板直方圖有明顯影響。大的血小板凝塊,體積大于20fl,不僅使血小板計數減少,即假性減低而且使血小板直方圖尾部升高(類似于小紅細胞對血小板直方圖的干擾)。??

　　如紅細胞凝塊,由于體積較大,不僅可以計數到紅細胞數中,使紅細胞計數假性增高，而且使血小板直方圖整個曲線水平抬高,成為一條類似水平的曲線。??

　　五分類血球分析儀由于采用的多種技術,它們顯示的不是細胞體積的直方圖,而是三維狀態的散點圖。正常的血細胞在散點圖上有其固定的位置和形態,如果散點圖異常,也同樣提示有異常細胞出現,同樣應當進行血涂片檢查。我前面已經說過,不論生產廠家采取什么樣的技術和措施,儀器如何升級換代,都代替不了人工顯微鏡下對細胞形態的真實觀察。??

(二)尿沉渣檢查的標準化??

　　1.尿沉渣檢查的指征:??
　　美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)規定凡有下述情況的應進行顯微鏡檢驗:?
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　　(A)醫生提出鏡檢要求的?
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　　(B)檢驗科規定的患者(如泌尿科、腎病科、糖尿病，應用免疫抑制劑及妊娠婦女)??
　　(C)任何一項理化檢驗結果異常的。??
　　我國檢驗學會規定凡紅細胞,白細胞,蛋白和亞硝酸鹽四項干化學檢查中有其中任何一項不正常者都應進行顯微鏡檢查，并以顯微鏡檢查報告為準。??
　　那也就是說,只有干化學法檢測尿液紅細胸,白細胞,蛋白和亞硝酸鹽四項檢查均陰性(正常)時,檢驗人員可不做顯微鏡檢查(復查)。?
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　　2.尿沉渣檢查的標準化:??

　　尿沉渣顯微鏡檢查是尿液分析中的重要組成成分,其在泌尿系統疾病中的診斷價值已被臨床醫生所肯定。但是,長期以來,因尿沉渣成分復雜,檢查難度大,又缺乏標準化和有效的質量控制措施,使得這項檢查對臨床診斷的意義大打折扣。??

　　1995年NCCLS,JCCLS以及1997年歐洲尿分析協作組都先后制定文件,規范尿沉渣的檢查方法。這些文件雖然具體內容上略有不同,但都強調:?
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　　(1)檢測尿液要新鮮,要使用帶刻度,尖底離心管??
　　(2)尿標本必須定量,按標準化要求定時,定速離心沉淀,留置離心尿要一致??
　　(3)尿沉渣必須定量檢測,經顯微鏡下確證??
　　(4)用專用術語和單位體積定量報告結果。??
　　1997年第二版《全國臨床檢驗操作規程》中是這樣規定的:??
　　(1)標本采集:晨尿,1小時內送檢??
　　(2)標本處理:10ml,加入帶刻度的離心管(沒有具體規定非是尖底不可,但最好用尖底管)500g,離心5分鐘,留取尿沉渣0.2ml??
　　(3)樣品制作:0.2ml尿沉渣滴在干燥清潔的玻片上,加蓋18mm×18mm的蓋玻片??
　　(4)檢查方法:濕片法,不染色,普通光鏡,計數細胞要觀察10個高倍視野,計數管型要觀察20個低倍視野??
　　(5)結果報告:細胞以每高倍視野最低-最高數,管型以每低倍視野平均數。??
　　標準化之中非常重要的就是定量報告的方式。??

　　3.尿沉渣板定量分析:??
　　A.器材??
　　(a)尿沉渣離心管:帶有刻度,可放10ml尿液,管底有一個"凸凸頭"。當傾倒離心后的上清尿液時,"凸凸頭"里的尿沉渣不會流出,大約容量為10ml。??
　　(b)尿沉渣定量分析板:每塊分析板上有10個均一厚度(0.1mm)計數池,每個計數池內有固定體積(1μl)的計數區(十數區內劃分10個中方格,每個中方格又劃分為9個小方格)。??
　　B.操作??
　　(a)取均勻混合尿10ml于離心管中,1500r/min,離心5min,倒去上清尿液。??
　　(b)取1小滴(15-20μl)尿沉渣沖入定量分析極其中一個計數池中,然后用低倍鏡觀察,高倍鏡計數,計數在1μl計數區內紅細胞,白細胞,上皮細胞和各類管型的數量。?
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　　C.參考值范圍??

　　非常不統一。??
　　傳統的尿沉渣檢查是放大400倍,觀察10個視野,如果每離倍鏡視野紅細胞超過3個,為鏡下血尿,臼細胞超過5個為白細胞尿。??
　　使用尿沉渣檢查,一般紅細胞少于8個/μl,但也有報告正常參考范圍是<5個/μl,兒童少于14/μl白細胞<10/μl。??
　　對于尿沉渣的檢查,建儀使用定量板法報告,而盡量不使用載玻片報告法,見表4。??
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　　從上表也可以看出,定量板法檢查的重復性明顯優于載玻片法。??

　　4.尿沉渣定量分析儀??

　　UF-100尿沉渣分析儀是按照血球計數儀的計數原理進行尿液中細胞計數的,而DiaSysR/S2003尿沉渣定量分析工作站是根據流動計數池計數的,它們的計數方法不同,到底兩者結果相關性如何,還缺乏大規模,多中心的研究。??

　　301醫院叢玉隆等人對400例正常人的尿液標本分別用四種方法進行定量計數,我用表5的形式歸納如下:??
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　　鎮江醫學院顧可梁等人用UF-100尿沉渣分析儀對83例健康人進行了檢查,報告參考范圍是:紅細胞,男性0-12/μl,女性0-19/μl白細胞,男性O-11/μl,女性0-32/μl發現男,女之間有明顯不同。?
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　　上述兩個調查值表明使用UF-100尿沉渣分析儀檢測的結果要比傳統離心法顯微鏡尿沉渣板檢查的結果要高。??

　　在不能普及尿沉渣自動分析儀的情況下,我國應當盡快統一規定,采用尿沉渣板進行定量報告為標準方法并確定參考值范圍。?