人體外周血淋巴細胞培養及染色體制片
實驗概要
學習和掌握人體微量血液體外培養制備染色體標本的方法。
實驗原理
人體的1ml
外周血中一般含有約1-3×106個小淋巴細胞，通常它們都處于間期的GO和G1期。在培養條件下給予藥物刺激時，經過53-72小時可在培養物中獲得大量的有絲分裂細胞，供染色體標本制備和分析之用。這種外周血培養方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
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人體外周血的形成包括紅細胞、白細胞、血小板，其中紅細胞和血小板不能離體培養。血細胞中的小淋巴細胞處于間期的GO和G1期。在培養時給予藥物刺激，可轉變為淋巴細胞，隨后進行有絲分裂。這樣經過66-72小時短期培養、秋水仙素處理，低滲和固定，就可獲得大量有絲分裂的細胞。這種微量全血培養技術已得到了廣泛的應用。
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1912年，Warfter 最先研究人類染色體。1923年，報道人類染色體的二倍體為48條。
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細胞遺傳學、組織培養技術為人類染色體的研究提供了條件。
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技術突破主要在于：
（1）人體外周血淋巴細胞培養和PHA的應用 ：PHA 是從菜豆種子中提取出來的，大量的PHA具有凝血作用。如果適合，可刺激細胞轉為母細胞，從而進行有絲分裂。
（2）秋水仙素的應用：秋水仙素可阻斷紡綞體截止于中期，使染色體個體大，結構清晰，縮短適度，細胞質粘度降低。
（3）低滲處理（水或0.075mlKcl）使紅細胞脹破，白細胞脹大，染色體空間變大，易伸展，便于觀察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培養人胚胎組織細胞，計數人體細胞染色體數為46條。1960年，Moorhead建立人體外周血培養技術，使染色體的研究躍進一步。1968年，T.U. Casperssan提出染色體顯帶技術。
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主要試劑
RPMI1640培養基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，雙抗，秋水仙素，低滲液：0.075Mol/L Kcl，卡諾氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸緩沖液(pH7.4-7.6)等。
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? 磷酸緩沖液的配制
0.1Mol/L 磷酸緩沖液(pH7.4-7.6):
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A:Na2HPO4?12H2O ? ? 28.8克 ? ? ? ? B:Na2HPO4?7H2O ? ? 2.164克
? ?KH2PO4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.67克 ? ? ? ? ? ?NaH2PO4?2H2O ? ? ?0.3克
? ?溶解于1000 ml雙蒸水中 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 溶解于1000 ml雙蒸水中
主要設備
2ml滅菌注射器，離心機，電子天平，恒溫培養箱，除菌濾器，顯微鏡，酒精燈，載玻片等。
實驗材料
人的外周血淋巴細胞
實驗步驟
1．器皿清洗滅菌
?清洗：洗衣粉煮、洗液浸泡，流水沖洗，雙蒸水沖洗
?滅菌：烘箱干熱滅菌160℃，30分鐘（玻璃器皿）
? ? ? ?濕滅15磅，30分鐘（藥品，KCl，秋水仙素）
2．培養基的制備與分裝
?成分：PRMI1640 80%（培養液：多種氨基酸，維生素，糖，無機鹽）
? ? ? ?小牛血清20% (細胞繁殖促進劑，4℃保存，用前50℃滅活，30分鐘)
? ? ? ?PHA0.04mg/ml
? ? ? ?雙抗或慶大霉素：100單位/ml
?滅菌：RPMI 1640 經抽濾滅菌
?分裝：5ml/ 瓶，4℃保存
3．接血培養
?接血：注射器用肝素濕潤后抽靜脈血0.3ml/瓶，7號個頭15滴。
?培養：37℃恒溫培養66-72小時，不時搖動。
?阻斷：收集前2-4小時加秋水仙素，使其終濃度為0.4-0.8μg/ml(7號針頭2?
滴，6號針頭3滴)。
4．細胞懸浮液制備與制片（離心管中操作）
?（1）收集細胞：2000rpm 10 分鐘，棄上清，用吸管打勻沉淀。
?（2）低滲：加入5ml溫育的0.075Mol/L Kcl，用滴管輕輕沖打成細胞懸浮液，37℃培養30分鐘，使紅細胞、血小板破碎，白細胞膨脹。
?（3）預固定：加管壁緩緩加入1ml固定液（以免砸碎細胞），靜置5分鐘。固定液使紅細胞破裂后出來的血紅蛋白變性，防止白細胞聚集成團。
?（4）收集白細胞：2000rpm，10分鐘，棄上清。
?（5）再固定：加入5ml固定液，靜止30分鐘，白色絮狀物為白細胞。2000rpm，10分鐘，棄上清。
?（6）制片：加入固定液0.4ml，用滴管小心沖打成細胞懸浮液。距4℃預冷的載玻片半米處滴片，2-3滴/片，吹片。
?（7）干燥：37℃干燥。
?（8）染色：用Geimsa染色液染色30分鐘，然后倒去多余染液，并用蒸餾水輕輕沖洗。
?（9）鏡檢：待稍干后，在顯微鏡下觀察。
