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清華大學張新榮近年來單細胞質譜分析領域工作進展概覽

2022.11.07

　　張新榮，清華大學教授，博士生導師。兼任中國分析測試協會副理事長，北京質譜學會理事長，英國皇家化學會會士，Analytical Chemistry（ACS）執行主編。張新榮教授課題組近年來致力于單細胞質譜分析研究，與同行學者和企業合作，研制了液滴微萃取-皮升電噴霧質譜單細胞分析儀、免標記質譜流式細胞儀以及極紫外激光電離質譜單細胞成像分析儀等，并將其用于單細胞乃至亞細胞區域代謝組的分析和空間單核代謝組的分析等。

　　本文選取張新榮教授課題組近年來在單細胞質譜分析領域的相關文章來介紹課題組最近的主要研究工作。

　　（一）液滴微萃取-皮升電噴霧質譜單細胞分析研究

　　從大量正常細胞中將癌細胞篩選出來，對癌細胞亞型進行代謝分型及潛在的標志物分子的篩選，對于癌癥診斷和治療有重要意義。該課題組在大量前期工作的基礎上，與寧波華儀寧創儀器公司合作，研制了一臺液滴微萃取-皮升電噴霧質譜單細胞代謝物分析儀器，能夠提取細胞內數百種代謝物并利用多級質譜對潛在的標志物成分進行分子確認。

圖1. (a) 液滴微萃取結合皮升電噴霧（Pico-ESI）質譜工作流程。在2分鐘內從單個細胞中獲得了超過600個MS2。(b,c) Pico-ESI相比Nano-ESI提供了更充足的單細胞分析時長。(d) 單細胞代謝物分析全自動樣品處理系統SinCell-100。

　　使用微納液滴對癌細胞代謝物進行萃取，并應用Pico-ESI延長電噴霧時間，能夠記錄來自單個細胞的600多個代謝物的串聯質譜圖（MS2），識別出超過300種磷脂分子，最終發現膠質母細胞瘤細胞中不飽和比飽和磷脂酰膽堿（PCs）的比值明顯高于正常細胞（Anal. Chem. 2018, 90, 9897-9903）。

　　該課題組還采用極性不同的萃取劑進行兩步萃取和電噴霧質譜測定，進一步提高了代謝物的覆蓋度。細胞內包含的代謝物種類豐富，具備不同的極性和溶解性。通過兩步萃取結合質譜分析從單個細胞中提取了千余個來源于脂質、能量代謝物等小分子的特征離子信號m/z，成功區分了四種乳腺癌亞型，篩選出若干種潛在的生物標志物（Anal. Chem. 2019, 91, 3667-3674）。

　　亞細胞尺度的分析可以揭示代謝物在胞內不同細胞器區域的富集分布。該課題組與北海道大學合作，在亞細胞層級（<10 μm）上分離和分析了單個脂滴（LD）中的磷脂酰膽堿和甘油三酸酯。該方法已成功應用于HepG2細胞中單個LD水平上三種不同LDs的脂質分布研究，將單細胞分析深入到亞細胞區域（Anal. Chem. 2019, 91, 4466-4471）。

圖2. (a,b) 針尖吸取單個脂滴前后的明場觀察圖像。(c) m/z 760.58 (PC 34:1) 和 m/z 902.82 (TG 54:3)的提取離子流圖。(d,e) PC 34:1和TG 54:3隨溶劑梯度被先后檢出。(f) Anal. Chem. 2019, 91, 7 的封面報道。

　　（二）免標記質譜流式細胞分析平臺

　　將質譜的代謝物檢測能力和流式細胞系統的高通量特點相結合，能夠加快單細胞代謝物篩選的速度，實現樣本中大量細胞的高通量快速檢測，進而實現對病人體液樣本中癌細胞的識別和分子組成分析，有望為臨床癌癥診斷提供更為豐富的信息。為此，該課題組在上述單細胞質譜儀器研究的基礎上，建立了免標記單細胞質譜流式平臺（CyESI-MS）。相對于傳統熒光流式細胞技術，有機質譜流式細胞技術提供了更為豐富的單細胞分子指紋的信息，用于更好地區分正常細胞與癌癥細胞，并對癌細胞進行了更為精準的分型。此外，相比于免疫分析，免標記代謝分析摒棄了標記程序，大大簡化了操作程序，加快了檢測的速度，有望用于臨床癌細胞在單細胞尺度的精準診斷（Anal. Chem. 2019, 91, 9777-9783）。

　　白血病是造血干細胞出現惡性克隆而引發的異質性疾病，不同類型急性白血病有著截然不同的化療方案和預后效果，因此在單細胞水平上對白血病細胞的準確分型具有重要的意義。該課題組從5種亞型白血病單細胞質譜圖中，提取出480個代謝物相關的離子峰并比較其指紋圖譜，發現存在明顯差異，進一步篩選并指認出了36種存在顯著性差異的代謝物，僅使用其中4種代謝物（谷胱甘肽、PC(32:1)、PC(O-34:1)、PC(P-34:0)）即可區分5種不同亞型的白血病單細胞，驗證了該方法在篩選生物學標志物方面存在的巨大潛力（Anal. Chem. 2021, 93, 10282-10291）。

圖3. 細胞代謝指紋圖譜用于鑒別白血病細胞。(a) 五種白血病細胞系1923個單細胞的代謝譜熱圖（正離子模式）。(b) 基于至少一種白血病亞型中檢出率大于90%的離子峰的無監督學習t-SNE聚類分析。(c) 五種白血病細胞系和一個混合樣本的t-SNE聚類分析。(d) 混合細胞樣品的檢測序列。

　　自然殺傷細胞（NK細胞）是一種重要的免疫細胞。由于腫瘤細胞所處微環境不同，其對NK細胞的抗性也存在著明顯的差異，因此在單細胞水平上研究NK細胞對腫瘤細胞的殺傷能力具有重要意義。該課題組從被NK細胞殺傷的單個癌細胞中提取出330余個代謝物相關的離子峰，進一步篩選并指認出了19種存在顯著性差異的代謝物，并發現部分代謝物如谷胱甘肽等與NK細胞數量高度相關，通過腫瘤細胞對于NK細胞殺傷的異質性，進一步實現了腫瘤細胞的精細化分型（Chem. Sci. 2022, 13, 1641-1647）。

圖4. NK細胞誘導HepG2細胞凋亡特異性代謝物的變化。(a) 19種不同效靶比下比值特征代謝物的平均相對強度對數雷達圖。(b) NK細胞誘導的細胞凋亡過程中，有幾個代謝途徑受到影響：(1) 甘油磷脂代謝，(2) D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，(3) 牛磺酸和下牛磺酸代謝，(4) 谷胱甘肽代謝，(5) 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。凋亡過程中單個細胞中 (c) 谷胱甘肽、(d) 谷氨酸、(e) 肌酸、(f) 牛磺酸相對強度的變化。

　　（三）空間單核代謝組學方法

　　腫瘤細胞亞群間的異質性不僅反映在組成成分之間的差異，還存在空間的異質性差異。這不僅由于腫瘤亞群在單個疾病部位內或不同疾病部位之間分布不均，腫瘤細胞與其周圍微環境間的相互作用亦會對細胞的異質性產生影響甚至促進腫瘤進展。因此，定位單個細胞在組織網絡中的位置、區分相關代謝物的指紋圖譜差異、確定重要代謝物的分子組成、研究微環境中分子分布的影響，對于單細胞代謝組學研究有重要的意義。

　　該課題組與同行合作開發了空間單核代謝組學方法（SEAM），將顯微光學成像與TOF-SIMS的高空間分辨率質譜成像相結合，使用大約1.5 μm的像素大小，從400×400 μm2的組織區域記錄多達300種離子物種的原位代謝曲線，并結合機器學習算法，可進行組織原位單細胞核水平上的代謝物可視化圖像識別、代謝特征信息提取、以及單細胞的聚類、差異化分析和微環境影響研究。

　　在方法學研究基礎上，該課題組對小鼠肝臟切片中的細胞核進行了分析，確定了724個不同的細胞核，同時報告了它們的代謝組。TOF-SIMS代謝組學數據集的建模揭示了細胞核化學性質不同的細胞亞群。這一發現與報道的通過蛋白或者基因表達所驗證的肝組織分區現象（liver zonation）高度一致，有效證明了SEAM方法的可靠性和準確性。

圖5. SEAM的概述。左上，玻片上的組織樣本被TOF-SIMS分析，右上是質譜和離子圖像的多重SIMS數據。左下，小鼠肝臟CV區H&E染色。底部中間，用SIMS-View獲得彩色編碼的像素可視化。右下，由SIMS-Cut、SIMS-ID和聚類等順序算法獲得空間單核圖。比例尺，100 μm。

　　在成功構建了基于高分辨質譜技術的細胞器空間代謝組學分析方法后，該課題組還研究了肝癌組織切片中細胞核的代謝狀態，區分了肝細胞亞群與纖維化微環境的關系。肝纖維化樣本中存在著2種有明顯代謝差異的肝細胞亞群，區分亞群細胞的主要特征在于谷丙酰胺含量的上升及其對應的跨膜轉運蛋白的基因表達上調。該課題組將代謝組學與轉錄組學進行了結合，證明了代謝組學分型的準確性與可靠性，并提供了其他組學無法提供的大量代謝物異質性信息。SEAM方法系統解析了組織空間中的單細胞代謝組，對于整個單細胞技術領域的進步具有重要的推進作用（Nat. Methods, 2021, 18, 1223-1232）。

圖6. (a) 小鼠肝組織差異代謝譜分析。(b) 以代表性差異代謝特征的強度著色的UMAP。(c) 肝細胞C1標志物之一m/z 87.00的空間分布。左：肝細胞C1的空間定位與m/z 87.00的灰度離子圖像合并。中間為m/z 134.04 (藍色) 和m/z 87.00 (紅色) 的離子圖像疊加。右，梯度定位分析突出了CV區 (黃色虛線區域) 周圍m/z 87.00的代謝偽流。比例尺，100 μm。

　　以上為張新榮教授課題組近年來在單細胞質譜分析領域具有代表性的工作成果，其它更多具體詳細的信息請參考課題組的網站：http://xrzhanggroup.com/%E9%A6%96%E9%A1%B5/