體外診斷中的核酸提取純化的方法及原理

目前，新冠疫情在全球席卷開來，對于如何確認是否感染，使用體外診斷核酸檢測方法仍是不可或缺的手段。

體外診斷，是指在人體之外，通過對人體樣本(血液、體液、組織等)進行檢測而獲取臨床診斷信息，進而判斷疾病或機體功能的產品和服務。

而檢測人體樣本的關鍵步驟之一，即是樣本中的核酸（DNA和RNA）純化。核酸純化的方法是影響所提取核酸質量的重要因素，只有高質量的核酸才能滿足下游的各種應用。

核酸是分子生物學的基礎，而核酸提取是核酸檢測，乃至于整個分子行業繞不過去的門檻，很多時候一份樣本的核酸提取的好壞直接決定了檢測結果的有效性。

（一）核酸的基礎知識

核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根據功能的不同分為核糖體RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和轉移RNA（t RNA）。

DNA主要集中在細胞核內，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細胞質當中。

（二） 為什么需要核酸提取？

核酸提取為大量廣泛研究和應用提供了答案（例如：克隆、qRT-PCR和全基因組、轉錄組范疇中的二代測序技術），獲得的核酸可以多種方式進行應用。

準確的研究目的，決定了要提取的核酸類型；核酸的應用往往影響提取方法的選擇。（例如：標準的End-point PCR反應，不需要與全基因組測序實驗相同的DNA質量）

為了確定最佳的研究方法，有必要清楚了解核酸的下游應用以及任何與樣品類型相關的潛在限制。（例如，臨床樣品采集量往往有限，核酸提取存在挑戰。）

雖然依據樣品類型，細胞裂解方式不同，但整體的核酸提取核心原則不變：細胞或組織樣品裂解，去除非核酸污染物（例如，蛋白質等）。

（三）核酸提取純化原則和要求

1、保證核酸一級結構的完整性

2、排除其它分子的污染（如提取DNA時排除RNA的干擾）

3、核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

4、其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降到最低程度；

5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時應去除RNA，反之亦然。

（四）常見核酸提取純化方法

1、苯酚氯仿抽提法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質的變性劑，反復抽提，使蛋白質變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子，變性降解核蛋白，使DNA從核蛋白中游離出來。而DNA易溶于水，卻不溶于有機溶劑。蛋白質分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質分子能順利地進入到水溶液中形成穩定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質的這種膠體穩定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質則沉淀于兩相之間。利用萃取原理，根據蛋白核酸溶于不同的試劑層，將槍頭伸入不同液層內抽取所需的成分，經多次洗滌后獲得純化核酸。

缺點是由于使用了苯酚、氯仿等試劑，毒性較大，長時間操作對人員健康有較大影響，而且核酸的回收率較低，損失量較大，由于操作體系大，不同實驗人員操作重復性差，不利于保護RNA，很難進行微量化的操作。

優點是采用了實驗室常見的試劑和藥品，做起來成本比較低廉。

2、 離心柱純化

此種方法是利用核酸表面會覆蓋一層由水分子構成的薄膜，在高鹽環境下，這層親水膜會遭到破壞從而核酸可被吸附在離心柱上，而其他雜質如蛋白質、代謝產物等則會被離心沉淀與核酸分離。最后通過洗脫，將核酸從吸附膜上脫離，即可得到純化后的核酸。離心柱純化也是的試劑盒提取中廣泛的使用方法。

但即便如此，離心柱純化法仍存在缺點：

高度依賴吸附膜的結合能力；

洗脫不完全導致核酸流失；

無法大量提取核酸。

離心柱純化法示意圖

3、磁珠法核酸分離技術

攜帶正電荷的磁珠易于吸附負電荷的核酸，主要用于從人血清或血漿樣品中提取DNA 和RNA（例如從血液樣本中檢測HIV 或HBV 病毒基因組的樣品制備）。一般而言，將樣品與結合緩沖液和磁珠混合，核酸與磁珠結合后，經過數次洗滌與磁場捕獲，洗脫下來的核酸即可通過PCR 或其它特定方法來檢測特定的DNA或RNA。磁分離法也是廣泛應用于診斷行業，且能實現高通量、自動化的核酸提取方法。

磁珠法提取示意圖

不同類型基因檢測均會涉及到核酸的提取和純化步驟。核酸提取純化的方法中，液體法和離心柱法均會涉及到有毒有機物的使用，對環境和實驗操作者均存在一定的危害。而磁珠法需要相應特殊配制的磁珠緩沖液和特異修飾后的磁珠，從成本和操作方面來分析，均存在成本高且操作步驟繁瑣，同時，也限制了自動化的進程和應用的推廣。因此，開發一種能快速釋放核酸并且對后續基因檢測實驗無影響核酸快速釋放方法成為目前亟待解決的問題。針對現有技術存在的問題，蘇州先達基因（www.gendx.cn）提供一種核酸釋放劑及快速釋放核酸的方法及其應用，能夠大大縮短核酸提取純時間化、降低制造成本，同時具有操作簡單的優勢。

4、先達基因核酸快速釋放技術

DNA釋放劑

蘇州先達基因DNA釋放試劑盒，專用于從各種常見的樣品中快速釋放恒溫熒光擴增的 DNA，具有以下特點：

1. 核酸釋放劑可以快速裂解樣品，使樣品的 DNA 游離在溶液中。無需自備任何試劑，不使用苯酚、氯仿等有毒試劑。

2. 操作簡單，只用一步（約 3min）即可得到用于恒溫熒光擴增的 DNA 模板，不需要任何離心、抽提等操作步驟。

3. 全過程僅在一個離心管內完成，避免微量樣品的損失，且不容易交叉污染，比常用的抽提試劑盒簡單，方便。

4. 兼容性廣，適用于常見的分子生物學樣品，包括細菌、昆蟲、各種動物組織、口腔細胞、毛發、組織中的細菌和病毒等。

DNA釋放劑使用方法

應用領域：

生命科學研究、分子診斷、動物疫情檢測、食品安全檢測、疾控/突發傳染病檢測、精準用藥基因檢測

RNA快速提取試劑盒

本試劑盒是先達基因為匹配現有的ERA等溫擴增技術，著力為實現分子診斷POCT化而自主開發的一款核酸快速提取產品。本產品可在5min之內快速完成對組織、血液、拭子、細胞等不同少量以及微量樣品中病毒的RNA提取和純化。利用本產品提取獲得的RNA可直接應用于核酸擴增及檢測、體外逆轉錄、基因克隆、文庫構建、雜交等多種生物學實驗及研究。

特點：

5分鐘內即可快速提取和純化得到高品質的RNA；

樣本要求量低，RNA提取產量可達到25ug；

操作簡便，只需5個操作步驟；

不含酚/氯仿等有毒有害試劑。

RNA快速提取流程圖

目前核酸分離技術雖然發展迅速，但是均存在一些缺點，例如:酚氯仿抽提法雖然核酸純度高，但是其主要成分對人體有害，且容易造成環境污染，同時提取過程需要反復抽提，多次換管，步驟繁瑣，會造成樣本的丟失與污染；磁珠法因提取成本較高，從而限制了廣泛應用。

先達基因的試劑用于生物樣本病毒DNA提取，樣本需求量少、操作簡便、無需繁瑣的離心、洗脫等步驟，微量核酸釋放劑在完全釋放核酸的同時，還具有操作簡便、使用安全、成本低的優點，適合在臨床基因檢測中推廣應用。