檢測抗生素殘留常用的快速檢測方法介紹
抗生素殘留快速檢測技術
1、傳統微生物抑制試驗(MIT)
分析大量樣品中抗生素的殘留物通常采用 MIT 法。這些方法是建立在活性藥物抑制微生物生長能力的基礎上。通用的抑制試驗是圓盤檢驗技術。將樣品提取液點在接種有試驗菌的瓊脂上,培養后可測定抗菌藥物形成的抑菌圈。抑菌圈表明抗生素的存在,而圈的大小則與抗生素的濃度有關。
嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法? 20世紀80～90年代,國際上公認并作為法定檢測食品中抗生素殘留的方法首推嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法(Paper disk method using Bacillus Steraroth-mophillus)。1977年由 Kaufman 提出,利用 Difco 抗生素4號培養基接種嗜熱脂肪芽孢桿菌芽胞,把接種培養基6mL 倒入各個15mm×100mm 的培養皿中(平皿需于7天內使用),紙片直徑12.7mm浸漬奶樣,放于瓊脂上,把平皿于64℃培養2h或者55℃培養4h。培養結束,用毫米游標尺測量抑菌圈直徑,陽性結果以≥16mm 為準,能檢出牛奶中青霉素含量0.005U/mL,本法可進行定量測定,1981年由FDA認可,1982年1月1日起生效為法定方法。
此法優點如下:
①用嗜熱脂肪芽孢桿菌芽胞懸浮物代替藤黃八迭球菌過夜肉湯培養物做試驗菌,故性質更穩定,貯存時間更長可達6～8個月。
②檢測敏感度高,能檢出牛奶中青霉素 G 含量為0.005U/mL(即5μg/kg)。
③方法簡便、快速、省錢,2～4h 即可出現抑菌圈。
④不僅能檢測青霉素 G,還能檢測其他多種常用抗生素如氨芐青霉素、頭孢菌素、鄰氯青霉素和四環素等。
⑤可作定量測定。
⑥不受消毒劑干擾。
2、氯化三苯四氮唑法(TTC)
(1)原理? ?細菌生物氧化有三種方式,即加氧、脫氧和脫電子,相反即還原。當乳中加嗜熱鏈球菌后,如乳中無抗生素,嗜熱鏈球菌就生長繁殖,在新陳代謝過程中進行生物氧化,其中脫出的氫可以和加在乳中的氧化型 TTC 結合而成為還原型 TTC,氧化型 TTC 是無色的,還原型 TTC 是紅色,所以可使乳變紅色。相反,如乳中存在抗生素,嗜熱鏈球菌就不能生長繁殖,沒有氫釋放,TTC 也不被還原仍為無色,乳汁也無色。
(2)檢測步驟檢測程序見下圖
①培養基和菌種
a.脫脂乳? 經113℃滅菌20min。
b.TTC 試劑? 采用4%的2,3,5-氯化三苯四氮唑水溶液。
先稱取2,3,5-氯化三苯四氮唑1g,溶于5mL 滅菌蒸餾水內,裝入褐色瓶內,置于7℃冰箱內保存。臨時再用滅菌蒸餾水稀釋至5倍。如遇溶液變為玉色或淡褐色,則不能再用。
c.菌種嗜熱乳酸鏈球菌應注意傳代,以保持其生長繁殖的活力。
②操作步驟
a.菌液制備將菌種移種脫脂乳,經36℃±1℃培養15h 后,以滅菌脫脂乳1:1稀釋待用。
b.取檢樣9mL,置15mm×150mm 試管內80℃水浴加熱5min 后冷卻至37℃以下加菌液1mL,36C±1℃水浴培養2h,加 TTC 0.3mL,36℃±1℃水浴培養20min,觀察如為陽性,再于水浴中培養30min 作第二次觀察。每份檢樣作二份,另外再作陰性和陽性對照各一份,陽性對照管用無抗生素的乳8mL 加抗生素及菌液和 TTC,陰性對照管用無抗生素乳9mL 加菌液和 TTC。
c.判斷方法? 準確培養30 min 觀察結果,如為陽性,再繼續培養30 min 作第二次觀察。觀察時要迅速,避免光照過久發生干擾。乳中有抗生素存在,則檢樣中雖加入菌液培養物,但因細菌的繁殖受到抑制,因此指示劑 TTC 不還原,不顯色。與此相反,如果沒有抗生素存在,則加入菌液即行增殖,TTC 被還原而顯紅色。也就是檢樣呈乳的原色時為陽性,呈紅色為陰性,見下表。
顯色狀態判斷標準
顯色狀態 | 判斷 | 顯色狀態 | 判斷 |
未顯色者 | 可疑 | 桃紅色～紅色 | 陰性 |
微紅色者 | 可疑 | 桃紅色～紅色 | 陰性 |
檢測各種抗生素的靈敏度見下表。
檢測各種抗生素的靈敏度
抗生素名稱 | 最低檢出量 | 抗生素名稱 | 最低檢出量 |
青霉素 | 0.004mg/kg | 慶大霉素 | 0.4mg/kg |
鏈霉素 | 0.5mg/kg | 卡那霉素 | 5mg/kg |
近年來,又有數種方法問世,國外許多公司已將有關MIT試劑盒商品化。在上述所有方法中,含有顏色指示劑的瓊脂的 pH 值改變是與細菌的生長的程度成正比,這使得使用者可明顯而清楚地檢驗可能含有的抗生素殘留。雖然這些試劑盒便于使用,而且這些抑制試驗也是一種很好的初篩技術,但缺乏靈敏度和特異性,不過對于其他的分析方法是一種補充,需要用其他分析法進行相互印證。
