新一代測序技術的先鋒-SOLiD系統
2008年12月
作為上世紀生命科學領域最重要的技術發明之一，測序技術深刻地改變了我們對生命本質的理解和掌控能力。假如沒有測序技術，基因序列就無法確定，酶切、克隆、反轉錄、cDNA、PCR、SNP、RNAi等等研究技術也就根本無從談起，生命科學領域也不會有今日的蓬勃發展。無人不曉的GenBank；歷時13年、耗資3億美元、全球合作的人類基因組計劃，無不建立在測序的基礎上，極大地推動了全球生命科學領域研究的發展。
但是，人類永遠不會停下創新的腳步。不斷創新，把原本不可能的變為可能，把既慢又費力的工作變為簡單快捷，本來就是科技最奇妙、最吸引人的地方。生命科學領域更不例外。
科學家一直在努力尋求測序技術的創新。新一代測序技術的誕生和發展，令1000人基因組計劃，以及各物種的基因組圖譜如雨后春筍般地涌現。歷時13年耗資3億美元的HGP從此成為歷史------完成人類基因組測序，如今只要區區1萬美元，1輪反應，1個實驗室，數周時間----新一代測序技術將生命科學帶入了測序的新時代。其中2007年10月美國應用生物系統公司（ABI）全球首推、2008年已經升級到第3代的SOLiD系統更是其中的佼佼者。
回顧過去----切身體會測序法變遷
上世紀70年代自Sanger發明雙脫氧鏈末端終止測序法，生命科學研究進入了手工測序時代。新基因不斷被測序的喜悅，暫時掩蓋了手工測序的繁瑣和辛勞，畢竟，能前所之不能啊。長達66公分的測序玻板清潔硅化組裝、配膠倒膠、同位素標記、分段上樣、數小時的垂直板電泳、X光片壓片過夜、顯影定影、人工讀片、“鬼帶”分析….所有工作手工完成，高度技術依賴，必需放射性同位素。那時一個測序高手，條帶清晰分明的的壓片結果，絕對是整個大樓里人人艷羨的目標。
10年后ABI公司推出了世界上第一臺自動測序儀，讓部分“先富起來”的實驗室驕傲地告別了手工勞動、讀片和同位素。電泳速度相近的4色熒光染料替代了同位素，4個測序反應在一個條帶中就能完成，通過自動計算校正不同熒光染料的偏差，也提高了反應通量。毛細管電泳技術逐漸取代了平板膠電泳側吸，而且測序的全部操作都實現了自動化，包括自動灌膠、自動進樣，自動數據收集分析。測序的通量自然也在不斷增加，3700測序儀一天能讀取40萬個堿基，在13年內完成的第一個人類基因組計劃中立下了汗馬功勞。
13年太長，只爭朝夕
羅氏旗下454和illumina先后突破Sanger測序法，推出新一代測序技術的基因分析平臺，令測序技術再次成為關注的焦點。ABI隨后在2007年10月推出基于新一代測序法的平臺——SOLiD。從SOLiD到如今的SOLiD?3，短短一年時間，它上演了一出精彩的“一級方程式賽車”。
SOLiD全稱為?Sequencing?by?Oligonucleotide?Ligation?and?Detection，它的獨特之處在于以四色熒光標記寡核苷酸進行連續連接合成為基礎，取代了傳統的聚合酶連接反應，可對單拷貝DNA片段進行大規模擴增和高通量并行測序。這種替代能夠明顯減少因堿基錯配而出現的錯誤，消除相位不同步的問題，獲得更高的保真度。而SOLiD系統的另一秘密武器是采用末端配對分析和雙堿基編碼技術，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，從而減少原始數據錯誤，提供內在的校對功能。這樣，雙保險確保了SOLiD系統原始堿基數據的準確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時的準確度可以達到99.999%，是目前新一代基因分析技術中準確度最高的。
高度可擴展性又為SOLiD系統平添了更多魅力。SOLiD系統采用開放玻片式的結構，使用包被DNA樣品的微珠來輸入基因組信息。這些微珠添加到檢測玻片上，并由系統進行分析。微珠密度并不是一成不變的，系統支持更高密度的微珠富集。開放式玻片形式、微珠富集、以及軟件算法的結合，能使平臺輕松升級到更高的通量，而無需對基礎技術和配置做重大改變。如今的SOLiD
3系統每次運行能產生高達20GB可定位的測序數據。20GB，相當于人類全基因組的約7倍覆蓋度！這意味著過去13年的多國聯合工作現在一次運行就搞定了。而通量的升高也有望進一步降低基因組測序的費用，成本只需1萬美元的人類基因組測序指日可待。
SOLiD系統的可擴展性除了指測序規模，還包括了其功能應用。它不再是一臺單純的測序儀，而是成為功能更全面的基因分析儀。除了測序和重測序，還能進行全基因表達圖譜分析、SNP、microRNA、ChIP、甲基化等多種分析。
全基因表達圖譜分析
芯片大概是目前應用最廣泛的從全局角度分析基因表達整體模式的方法。然而，基于雜交技術的微陣列技術只限用于已知序列，無法檢測新的mRNA；而且雜交技術靈敏度有限，難以檢測低豐度的目標（需要更多的樣品量），難以檢測重復序列；也無法捕捉到目的基因表達水平的微小變化------而這恰恰是研究在刺激下或環境變化時的生物反應所必需的。
與芯片技術相比，基于測序的高靈敏SOLiD技術可對單個細胞和癌癥樣品中存在的痕量RNA進行整體的全基因組表達圖譜分析，每次運行能定位高達2億4千萬個標簽（mRNA的相對表達水平可通過系統產生的序列標簽數目來計算），可檢測低至每個細胞中10-40pg的總RNA，即使mRNA表達水平很低，SOLiD系統也能夠無偏向性地分析樣品中存在的已知和未知mRNA，從而定量特定mRNA的差異表達模式。起始樣品比微陣列技術要少得多，尤其適用于來源極為有限的生物樣品分析，如癌癥干細胞----分析其基因和非編碼RNA的表達圖譜有助于有助于加速發掘潛在的生物標志物，從而更準確區分不同的疾病類型以及識別疾病易感性，幫助于研究人員更好地了解病變細胞的特性。
更多RNA研究
除了單細胞基因表達圖譜分析，SOLiD系統在RNA方面的其他應用還包括：利用SOLiD?Small?RNA?Expression?Kit來發現和篩選小分子RNA，實現在無需預先知道序列信息的情況下高通量發現新的RNA分子。這個方案有望顯著地提高研究人員鑒別小分子RNA的能力，將過去不可能完成的實驗變為可能。目前已發現的microRNAs還非常有限，SOLiD可在不知道目標分子DNA序列的情況下進行檢測和定量小的RNA分子，可將樣品制備工作從常規方法的四天縮短為僅需一天，是分析在生物樣品中表達的已知和未知miRNA及其它小分子RNAs的有效工具。利用SOLiD?Whole?Transcriptome?Kit還可以探索和鑒定全轉錄本。SOLiD無可比擬的高通量和測序數據的高精確性使得可以用短序列讀長即可測序整個轉錄組。了解轉錄組對有助于解開導致復雜疾病的分子通路的秘密。這一系列應用補充使研究人員能在單個超高通量平臺上開展綜合的RNA研究。
SNP分析
盡管絕大多數的人類遺傳信息在所有人中都相同，但是研究人員通常更感興趣的是研究個體之間微小的遺傳差異。這種差異包括單堿基變異，以及被稱為結構變異的各種較大片段DNA序列變異。結構變異包括DNA片段的插入、缺失、倒位和易位，結構變異的DNA片段范圍可從幾個堿基對到數百萬個堿基對，可能對基因產生重要影響，并導致人類疾病的發生。SOLiD流程獲得的嚴密的片段范圍，使研究人員可以鑒別出很寬范圍內的插入和缺失片段，結構重排也能很容易鑒別出來。這個平臺的超高通量使研究人員可輕而易舉地獲得高度基因組覆蓋率的數據，精確鑒定個體基因組中存在的數百萬個單堿基多態性SNP，揭示大量此前未知、具有潛在醫學價值的遺傳變異，從而促進我們對正常/疾病狀態下DNA結構變異的了解，以及在更高的分辨率下對結構變異進行深入分析，解釋個體之間的易感性差異和對疾病治療應答的差異，最終實現個性化醫療。
甲基化分析
甲基化是自然發生的DNA化學修飾的一種。已知抑癌基因的失活與DNA序列特定區域的甲基化有關。而去甲基化則可能導致基因組不穩定和表達模式變化。DNA甲基化區域可能作為基因在癌癥過程中的標記。研究人員一直致力研究從正常到癌變過程中甲基化模式如何變化的，原癌基因異常甲基化模式在癌變過程中扮演怎樣的角色。SOLiD系統運行通量非常驚人，很快就可以做多個樣本全基因組甲基化模式檢測，使得研究人員可以鑒別基因組中對應元件的甲基化狀態，從而幫助研究人員檢測甲基化模式是否可以作為癌癥的生物標識，以及更好了解甲基化在癌變過程中扮演的角色。
著名的Sanger研究院和Broad研究院正利用SOLiD系統來探索人類基因組樣品中的遺傳變異。包括美國華盛頓大學醫學院、加利福尼亞大學Santa Barbara分校、哥倫比亞大學、澳洲昆士蘭大學、日本東京大學、荷蘭Hubrecht研究院、北京基因組研究院等等研究單位都先后配置了SOLiD系統。
SOLiD系統這個創新的平臺將過去種種夢想都變成了現實。未來，它將不僅改變生命科學，甚至可能改變我們的生活。也許，幾年后的出生體檢報告就是一份個人基因組圖譜，告訴你與生俱來了哪些遺傳變異，何時以及如何進行及時干預。
