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    空間轉錄組測序樣本準備指南

    2020.8.17

      一、外泌體研究熱度持續攀升

      外泌體(exosome)是活細胞分泌的30-200nm的囊泡,在電鏡下具有非常明顯單層膜結構,通常為茶托型或一側凹陷的半球形。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體,經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體,它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中,被視為特異性分泌的膜泡,參與細胞間通訊。

      有關外泌體分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的精確分子機制近些年剛剛開始受到關注,與外泌體相關的被pubmed收錄的文章數量和國自然基金項目中標數量逐年增長,表明國內外對外泌體的研究興趣日益增長(圖1)。

      圖1. 外泌體文章發表數目和國自然基金立項數目

       從圖1可以看到2019年國家自然科學基金獲批項目中,外泌體研究相關項目總數500多,比2018年增加了70多項,而下面圖2則顯示2019年外泌體立項總金額突破2億元,比2018年高4000多萬元!從這個趨勢來看,外泌體國自然立項必將持續走高,外泌體的研究仍大有可為!

      圖2. 近7年外泌體國自然總金額增長趨勢

       那么,2019年獲批的外泌體研究項目都集中在哪些領域,或者說研究方向呢?

      1.外泌體項目獲批學科方向

      從統計來看,與前年相似外泌體立項最集中的領域還是腫瘤學 (圖3),近年來外泌體發表的文章也絕大部分與其在腫瘤的形成,耐藥性,檢測等方面有關。例如2019年發表在Molecular Cancer (IF=10.679)上的文章表明外泌體FMR1-AS1通過TLR7/NFκB/c-My信號通路在女性食管癌中促進維持癌癥干細胞樣細胞的動態平衡。發表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research(IF=5.646)上的一篇文章發現外泌體轉運p-STAT3可促進結直腸癌細胞獲得性5-FU耐藥性。發表在Cancers(IF=6.162)上的一篇文章則研究了腹腔灌洗液中細胞外囊泡相關的miRNA作為子宮內膜癌分子標志物的可能性。此外,在神經系統和精神疾病,中醫學及其他領域也有不少外泌體相關項目中標。

      圖3. 2019年各學科外泌體相關項目中標數

       2.外泌體獲批項目中的熱點分子

      由于外泌體的主要功能被認為是細胞之間的信息傳遞,了解它帶有的蛋白質和多種RNA上的信息就變得尤其重要。2019年外泌體中標項目中帶有熱門話題miRNA、lncRNA和環狀RNA的項目數量如下圖(圖4)所示。我們可以看到,外泌體中的miRNA和lncRNA過去研究的是比較多了,例如發表在Hepatology(IF=14.971)上的一篇文章表明肝癌細胞釋放的外泌體miRNA調控巨噬細胞程序性死亡配體1的表達。另一篇文章發現膽管細胞來源的外泌體LncRNA H19促進肝星狀細胞活化和膽汁淤積性肝纖維化。相對的,外泌體中的circRNA研究目前還較少,而circRNA分子自身獨特的穩定性、組織特異性、時序和疾病特異性等,使它很有可能成為外泌體檢測的下一個熱門分子。

      圖4. 外泌體研究熱點分子

      3.外泌體項目中標金額

      最后,表1列舉了2019年外泌體基金中標金額前5的項目,可以看到外泌體的研究開始與應用聯系起來,與2018年項目金額前10的全部是分子機制的研究相比,2019年關于外泌體臨床應用的項目也能躋身前五。所有中標項目中,項目類型依然十分廣泛,從重點重大項目到青年科學項目均有外泌體相關研究。

      項目

      單位

      金額

      腫瘤細胞轉移的內驅力與外泌體

      浙江大學

      400萬

      特異性外泌體的功能機制及其作為新型腫瘤標志物在卵巢癌精準檢驗中的應用研究

      上海交通大學

      295萬

      外泌體活性依賴性釋放和腦膠質淋巴系統損傷介導慢性內臟痛的脊髓神經環路機制研究

      蘇州大學

      248萬

      瓦斯爆炸肺損傷分子機制及間充質干細胞及其外泌體修復作用研究

      新鄉醫學院

      218萬

      神經干細胞與膠質細胞釋放的外泌體在介導衰老與神經退行性病變中的作

      用及其分子機制研究

      同濟大學

      205萬

      表1. 2019外泌體中標金額前5項目

      值得一提的,近年關于外泌體在液體活檢中的應用有不少文章發表,例如發表在Journal of Cellular Physiology (IF=4.521)上的文章表明腫瘤來源外泌體lncRNA Exo-GAS5可能成為基于血清的鑒定早期非小細胞癌的分子標志物。發表在Journal of cellular and molecular medicine (IF=4.658)則顯示尿液外泌體miRNA可能成為透明細胞腎細胞癌的分子標志物。

      介紹了這么多外泌體項目中標情況,接下來我們看看外泌體的研究思路是怎樣的呢?

      二、外泌體研究思路

      外泌體研究通常與高通量測序的聯系最為緊密,研究思路可以分為三大類:表達譜、分子標志物和分子機制方向,其中表達譜思路的特點就是短平快、通常以測序數據為主要內容,短平快發表3-5分文章。而分子標志物的特點是在表達譜基礎之上加入大量樣本驗證,建立ROC、KM曲線,分析分子與臨床疾病的相關性為主,通常文章影響因子在3-10分之間。最后是分子機制研究,顧名思義要做到細胞功能、機制研究深度,因此工作量通常較大,影響因子通常能夠上10+。接下來我們就來詳細介紹一下這三種思路的具體案例。

      1.表達譜

      表達譜思路案例1(云序客戶)

      云序客戶2018年發表在Journal of Neurotrauma (IF=5.190) 上的Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice,是天津醫科大學總醫院張建寧教授帶領的神經創傷團隊針對大腦創傷的研究。下圖為大家整理了文章的研究思路。

      作者通過對小鼠腦周質外泌體的全轉錄組測序(本實驗云序提供)檢測到環狀RNA的表達變化。通過生信分析如GO及KEGG分析對外泌體差異表達的環狀RNA進行了功能預測。GO分析表明這些RNA分子主要參與神經損傷修復,神經系統發育及神經信號傳導相關,這些分子同時主要富集在cGMP-PKG信號通路。而環狀RNA-miRNA互作網絡圖揭示了環狀RNA作用靶miRNA及可能的功能。這篇文章研究了大腦創傷外泌體中環狀RNA變化,為后續分子機理詳細研究提供諸多靶分子,也為大腦創傷的干預治療提供潛在的靶點。

      表達譜思路案例2 (云序客戶)

      云序客戶2019年發表在Journal of Cellular Biochemistry (IF=3.448)上的Circular RNAs expression profiles in plasma exosomes from early‐stage lung adenocarcinoma and the potential biomarkers, 研究思路如下圖所示:

      作者通過對5個肺腺癌(LUAD)患者和5個健康人血漿外泌體的環狀RNA測序(本實驗云序提供),找出了105個上調和77個下調環狀RNA。然后在15個患者和15個健康人的血漿中通過qPCR確認到其中4個表達顯著上調。最后通過circRNA‐miRNA‐mRNA 相互作用網絡推測了這4個circRNA可能吸附的miRNA和它們可能的靶基因。

      2.分子標志物

      分子標志物思路案例1

      外泌體分子標志物的研究是在表達譜的基礎上進行更進一步的分析和篩選,并且通過擴大樣本驗證,來確認可以作為標志物的分子。這類研究與臨床應用聯系更緊密,近年來越來越受重視。2019年發表在Molecular Cancer(IF=10.679)上的文章Tumor-originated exosomal lncUEGC1 as a circulating biomarker for early-stage gastric cancer, 文章思路如下圖:

      作者分別從健康人(HC)和胃癌患者(GC)的血漿,培養的人胃上皮細胞(HPSEC)和胃癌細胞(GCC)中提取外泌體進行了鑒定,然后通過對lncRNA測序(云序提供此項服務),從差異外泌體中篩選出了lncUEGC1并用qPCR進行了驗證。最后,再擴大了樣本檢測, 通過ROC曲線分析證明了lncUEGC1有希望作為高效穩定的早期胃癌的分子標志物。

      分子標志物思路案例2

      發表在Clin Cancer Res (IF=10.199)上的Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generation sequencing,其文章研究思路如下圖:

      作者對46名非小細胞肺癌I期患者(其中惡性腺瘤26人,鱗狀細胞癌20人)和健康人血漿中的外泌體進行提取和鑒定,通過miRNA-seq (云序提供此項服務)和qPCR,篩選并驗證了4個只在惡性腺瘤外泌體中表達改變的miRNA,3個只在鱗狀細胞癌外泌體中表達改變的miRNA,以及4個在兩種細胞的外泌體中都表達改變的miRNA。最后擴大樣本,在60個患者中檢測驗證了患者體內miRNA組合與疾病診斷的準確性。這項研究篩選出了有望成為高敏感度、非侵入性檢驗早期非小細胞肺癌的分子標志物的外泌體miRNA。

      3.分子機制

      由于外泌體重要功能是細胞間的交流,其內攜帶的分子又種類繁多,研究揭示的外泌體影響的生物功能也是十分廣泛,涉及到哺乳動物的生殖和發育,免疫系統和感染,代謝和心血管疾病,神經退行性變以及癌癥腫瘤。研究外泌體在這些過程中的作用影響,以及經過哪些具體的通路,發表文章的周期會較長,但是相對的,影響因子也高,很多都在10分以上。

      分子機制案例

      2020年發表在The Journal of Clinical Investigation (IF=12.282)上的Exosomal long noncoding RNA LNMAT2 promotes lymphatic metastasis in bladder cancer, 揭示了外泌體lncRNA介導的淋巴轉移機制,并將LNMAT2作為膀胱癌淋巴轉移的治療靶點。下面我們來看一下文章的研究思路:

      作者首先通過LncRNA-seq(云序提供此項服務)篩選了在淋巴轉移的膀胱癌中上調的LNMAT2,并驗證了LNMAT2過表達使膀胱癌病人生存率降低。然后,原位雜交實驗將LNMAT2與膀胱癌外泌體聯系在一起,并通過提取鑒定外泌和qPCR進行了確認。接著,通過體外共孵育和體內實驗證明了上調LNMAT2能促進淋巴生成。最后為了探究LNMAT2作用的分子機制,巧妙利用了RNA pull -down+MS/WB、RIP、ChIP以及雙熒光素酶報告實驗等方法,發現并證實了hnRNPA2B1介導LNMAT2進入膀胱癌外泌體中,外泌體LNMAT2被人淋巴管內皮細胞攝取內化后,通過募集hnRNPA2B1和增加PROX1啟動子上的H3K4三甲基化水平,進一步上調PROX1表達,最終導致淋巴管生成和淋巴轉移。

      三、云序提供全轉錄組測序服務

      1.一站式服務:

      客戶只需提供體液樣本,云序生物為您完成從外泌體提取、外泌體鑒定、外泌體全轉錄組測序、RIP、RNA pull-down、雙熒光素酶報告實驗到數據分析整套服務流程。

      2.全面的檢測類型的RNA

      3.豐富的微量測序經驗

      云序生物作為以高通量測序技術為依托的科研服務公司,擁有豐富的微量樣本測序經驗,為眾多臨床與基礎科研研究者提供了高質量的科研服務,助力客戶發表過眾多微量樣本的SCI文章,其中包含多篇外泌體文章。

      雜志

      標題

      J. C.Inv

      IF=13.251

      Platelet-derived miR-223 promotes a phenotypic switch in arterial injury repair

      Nat. C.

      IF=12.35

      MicroRNA-27a controls the intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis by regulating calciumassociated autophagy

      Haematologica

      IF=7.7

      Histone modifier gene mutations in peripheral T-cell lymphoma not otherwise specified

      Mol. N. Acids

      IF=5.92

      Circular RNA Expression Profiling and the Potential Role of hsa_circ_0089172 in Hashimoto’s Thyroiditis via Sponging miR125a-3p

      Aging

      IF=5.515

      Hematoma-derived exosomes of chronic subdural hematoma promote abnormal angiogenesis and inhibit hematoma absorption through miR-144-5p

      J. Neurotrauma

      IF=5.19

      circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice

      Epigenomics

      IF=4.404

      CircRNA hsa_circ_0004771 promotes esophageal squamous cell cancer progression via miR-339-5p/CDC25A axis.

      Bio.P.

      IF=3.74

      Small RNA-sequencing identified the potential roles of neuron differentiation and MAPK signaling pathway in dilated cardiomyopathy

      J. Cell. Bi.

      IF=3.448

      Circular RNAs expression profiles in plasma exosomes from early-stage lung adenocarcinoma and the potential biomarkers

      Gene

      IF=2.638

      Profiling and bioinformatics analyses reveal differential circular RNA expression in ovarian cancer.

      Evid B.C.A.M

      IF=1.98

      Determination of Electroacupuncture Effects on circRNAs in Plasma Exosomes in Diabetic Mice: An RNA-Sequencing Approach

      Mol M. R.

      IF=1.85

      RNA sequencing discloses the genomewide profile of long noncoding RNAs in dilated cardiomyopathy

      Mol M. R.

      IF=1.692

      Upregulation of long noncoding RNA AP003419.16 predicts high risk of agingassociated idiopathic pulmonary fibrosis

      云序疫情期間針對外泌體的講座視頻已經全部錄好,對外泌體感興趣的老師可以點擊以下鏈接:


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