應用流式細胞儀檢測CD34+細胞方法學評價
應用流式細胞術（FACS）測定動員后的外周血及采集的自體外周血造血干細胞（APBSC）中的CD34+細胞及其亞群，操作簡單、快速、重復性好，對及時掌握最佳采集時機，準確判斷采集的干/祖細胞數量具有重要指導意義。為準確檢測外周血及APBSC中的CD34+細胞，本文比較了幾種FACS檢測CD34+細胞方法的異同。
1、材料與方法
1.1 外周血造血干細胞 APBSC采集自經環磷酰胺（CTX）＋重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）動員后的實體瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用CS3000- Plus血細胞分離機（Baxter公司，美國）。
1.2 CD34+細胞的標記 對10份APBSC分別進行2種不同再處理與CD34標記。
1.2.1 溶血法 APBSC與CD34-PE熒光單克隆抗體（Immunotec，法國）室溫暗處反應15min，然后用細胞裂解液溶解紅細胞，待測。
1.2.2 分離單個核細胞法 經Ficoll（相對密度1.007）梯度離心，收集界面層單個核細胞，與CD34-PE標記的單抗室溫孵育15 min，待測。
1.3 FACS檢測CD34+細胞 上述標記細胞懸液分為2管，其中一管6 h內使用流式細胞儀（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）測定CD34+細胞占單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）的百分率，另一管經1%多聚甲醛固定，4℃冰箱保存72 h后，FACS測定CD34+細胞數。
1.4 熒光標記的CD34單克隆抗體 33份APBSC同時分別用表達第2類抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ，Immunotec）和表達第3類抗原表位8G12（HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的單抗進行標記，比較2組CD34+細胞百分率之間的差異。
1.5 雙標記CD34/CD45 APBSC中同時加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法處理細胞，FACS測定CD34+細胞。
1.6 統計學處理 用t檢驗。
2、結果
2.1 溶血法與單個核細胞標記法測得CD34+ 細胞百分率無顯著性差異（P＞0.50）。
2.2 同一樣品經1%多聚甲醛固定72 h后的測定值與6 h內的測定值相比，CD34+ 細胞熒光強度降低，非特異吸附增加，變異系數范圍在 9.9%～49.5%之間，平均CV值為32.2%。
2.3 APBSC標本分別用2種CD34單體標記，CD34+細胞百分率無顯著性差異（P＞0.05）。
2.4 CD34-PE/CD45-FITC雙標記測定APBSC中CD34+細胞的百分率為4.5%，而同一組樣品進行CD34+細胞單色標記為5.3%。
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