免疫細胞化學與圖像分析-2
六、實例介紹
因為將免疫細胞化學方法與圖像分析結合起來進行研究的論文在國內國外都還不多。在第六屆國際學術會議上發表的90多篇論文中只有1篇，因此在實例介紹中，包括一部分不是免疫細胞化學方法，而是用其他組織學方法與圖像分析結合起來研究，但這種方法對研究免疫細胞化學標本也可借鑒，從中可得到一些啟發的，也在此選擇性地作一些介紹。
Mcmillan等1983年在第六屆國際體視學會議上曾報告了“用圖像信息處理機客觀評定免疫組織化學染色的組織”，闡明了當組織與第一抗體作用時，不斷攪動血清，明顯提高了免疫反應。Bordier 等1982年用圖像分析法對大鼠的神經垂體進行研究，闡明了軸突占神經垂體體積的一半，分泌顆粒占軸突體積的20%，加壓素的含量與分泌顆粒的體積密度無關，而與分泌顆粒內激素濃度有關。這些結果如不用圖像分析法是很難得出的。Steward等1983年用測量家雞腦單位面積內的突觸數目等，來研究與記憶形成有關的細胞學改變。
英國現在有300萬75歲以上的人，其中有五十萬人患有老年性癡呆（Alzheimer病），這種病過去認為是由于年齡增長的不可避免的現象。英國神經科學所用圖像分析儀與谷氨酸鹽受體的放射自顯影法結合起來對此病進行了重要的研究。由于放射自顯影會產生一些非特異性的結合，用圖像分析儀可以從全結合圖像減去非特異性結合圖像，而得到特異性結合圖像，可以測出特異性結合的百分率。目前已知道，老年性癡呆患者腦中，與記憶、理性行為及感情行為有關的區域內，神經元的進行性退變，神經遞質發生改變，影響了從一個神經元到另一個神經元的信息傳遞。
我國1991年11月出版的“計量學在形態學研究中應用學術研討會論文集“共收集論文123篇，其中有關免疫細胞化學與計量學結合的論文共8篇：①大鼠燙傷后下丘腦室旁核和視上核內AVP含量變化的形態學計量（第二軍醫大學張忠義等）用圖像分析儀測定AVP陽性反應物的面積。②人脊神經節 內SP、SK、CGRP免疫反應細胞的比率（中國醫科大學方秀斌等），用人工計數方法。③交感神經元和膽堿能神經元中ACh和ChAT顯示比較（軍事醫學科學院汪家政等），用圖像分析法測定各種參數。④大鼠脾樹狀突細胞的組織分布棗S—100蛋白標記和立體計量分析（南京鐵道醫學院張錦堃等）用目鏡標線片的測格進行定量研究。⑤垂體GH腺瘤細胞分泌顆粒的免疫膠體金定位檢測及定量分析（中國人民解放軍總醫院羅毅等），用圖像分析法測定各種參數。⑥胃腸粘膜重度異型增生與腺癌細胞核DNA含量的測定及免疫組化的比較研究（上海第二醫科大學吳平平等），用顯微分光光度系統進行DNA測量。⑦免疫組化在胃癌病理棗生物學分型中的價值（濱州醫學院張樹畢等），將免疫組化反應分為陽性陰性而進行比較。⑧人胎十二指腸EC細胞的體視學研究（江西醫學院朱清仙等）用目鏡標線片測格進行定量研究。由此可大致體現我國在此領域的研究現狀。
七、圖像分析與體視學
圖像分析還可用于三維重建，用連續切片可重建立體的原形，在神經組織的研究中很適用。我們在顯微鏡下觀察到的是平面圖像，而這些平面圖像是從立體結構中切下來的，單憑平面圖像不能反映組織的真實結構，例如圓形可以從球形、圓柱形、橢圓形物體中切下。如何從二維結構推導出三維結構，這就是所謂體視學（stereology）所研究的范疇。stereology 這個詞是1961年開始正式應用的，由于體視學與圖像分析的密切關系，無論是國際上的或國內的學術會議都將這二者放在一起討論。
將體視學知識與免疫細胞化學標本觀察聯系起來，將是一種可以獲取更多信息的研究手段，目前國外已很重視體視學的研究方法，發表了一些論文，國內也開始做這方面的工作，因此有必要將體視學的一些基本術語介紹給讀者，供參閱文獻時或自己進行研究時應用。體視學語言目前已是一種通用的術語，現將常用的介紹如下：
結構（structure）：在一個確定的組織模式中，由許多相互依賴的部分所組成的某物體稱為結構。一個結構至少有二個組分構成，體視學的目的即弄清楚各組分之間相互關聯程度、相對大小等。
組分（component）：在結構中能被截然分開而且能被辨認的部分。
相（phase）：所有在本質上相同的組分的集合稱為相。例如一個細胞的所有線粒體構成了此細胞的線粒體相。
粒子（partiele）：假如組分是由許多離散的并且能夠作為單元獨立存在的要素所組成，則將這些要素稱為粒子，粒子可以表現為各種形狀。
凸面體（convex solid）：連接此實體內任何兩點的線段，必需全部落于此實體內，換句話說，即此實體上切下的一個切片只能形成一個截面。
包容空間（containing space）：指包含被研究的組分的空間。當然，被研究的組分常與其他不被研究的組分并存。
密度（density）：單位體積、單位面積或單位長度內的量。
體積密度（volume density）：在單位包容空間內，某相的體積。
表面積密度（surface density）：單位包容空間內所含有某相的表面積。
長度密度（length density）：單位包容空間內某相的長度。
數密度(numerical density)：單位包容空間內某相的數目。
截面（profile）：任何結構的切片上的圖像。
體視學的測量值往往是相對測量值，以兩個彼此相關聯的測量值的比率來表達，其中一個測量值與組分有關，另一個測量值與包容空間在關，后者也稱為“參考系統”。體視學原理可確定在切片上測得的這些比率與空間結構內相應的比率之間的精確關系。上述性質反映在體視學符號中，而這些符號目前已普遍被使用，在有些文獻中已不再作解釋了。常用的符號如下：
P測試點數
P1單位測試線長上的交點數
Pa單位測試面積上的點數
Pv單位測試體積上的點數
L測試線長
L1單位測試線長上的截距
La單位測試面積上線的單元長
Lv單位測試體積上線的單元長
A測試面積
S表面積
Aa單位測試面積上被測物的面積
Sv單位測試體積內被測物的表面積
V體積
Vv單位測試體積內被測物的體積
N被測物數目
N1 單位測試線長上與被測物相交的數
NA單位測試線長上與被測物的數
Nv單位測試體積內被測物的數
用測試網格的體視學方法，楊光等，1987年曾對腹腔神經節 小強熒光細胞進行超微結構的定量分析，測量了線粒體、溶酶體、粗面內質網、顆粒小泡的Vv、Sv、Na、Nv等參數，得出了標準小強熒光細胞的計量值。此處的Vv即單位體積細胞質內某種細胞器的體積，據體視學原理，Vv等于切片上被測的某種細胞器所占的面積的均數a與細胞質的面積的均數A之比，如用圖像分析儀即可得出此二者的面積，而用測試格a等于落在此細胞器上的測試格的交點總數∑Pi，A等于落在細胞質上的測試格交點總數∑Pc。
Vv=ā／A=∑Pi/∑Pc
測試格的交點數有各種規格，如果有20條橫測試線與20條縱測試線組成的測試網格，則有400個交點，利用交點所落部位進行推算。
免疫組織化學形態計量研究中參照空間的“陷井”問題。在某種組織結構（參照空間）內測量特征物的密度值（如體積分數、表面積密度、長度密度、數目密度等），如果不知道參照空間的體積，得不到絕對值，就有可能作出錯誤的結論，就是參照空間的“陷井”。舉一例子說明：實驗的結果苯巴比妥對大鼠肝細胞中的內質網的體積分數和表面積密度無顯著差異，如果依此就認為苯巴妥對肝細胞（參照空間）內質網無顯著影響，就錯了，就進入了參照空間的“陷井”中去了。實際上，在些實驗條件下，肝細胞質總體積顯著增加，因而雖然內質網的體積分數和表面積密度無顯著差異，但其絕對值已顯著增加了。因此，要測量或估計參照空間的體積、乘以密度值，獲得絕對值，才能獲正確的結論。
八、國內外生產圖像分析儀的情況簡介
（一）國內情況
80年代初，以IBM—PC為代表的個人計算機得到了突飛猛進的大發展和在普及；緊接著各種功能強大面向圖像處理與分析的專用超大規模（VLSI）蕊片或單板達到商品化水平，兩者的結合，為微機圖像處理系統的問世奠定了硬件基礎。打破了以往只能在大中型計算機加專用圖像處理系統的構成價格昂貴的圖像處理系統的局面。為推廣圖像處理與分析技術創造了物質基礎。從80年代中期開始，國內先后有武漢大學、清華大學、中科院自動化所、計算所、重慶大學、四川大學、華北計算所等單位，紛紛進行微機圖像處理與分析系統的研制和推廣應用工作。其中以四川大學計算機系圖像圖形研究所研制開發并定型生產的MIAS系列圖像分析儀在國內具有較大的優勢，獲得了1992年國家級新產品證書。
現介紹如下：MIAS系列圖像分析儀包括偽彩色型MIAS—300，真彩色型MIAS—400，超高分辨率型MIAS—1000等面向生物醫學、金相分析、石油地質以及其它專用目的的各種圖像儀均由硬件系統和軟件系統兩大部分構成。硬件系統主要包括MIAS圖像處理計算機、圖像輸入設備，圖像輸出設備和交互式處理設備等。其主要性能指標：圖像分辨率512×512，640×480，1280×1024。圖像采集速度：電視方式0.04s/幀，慢速高精方式2～10秒/幀。圖像存儲體：MIAS—3000.5MB～1.5MB（兆字節 ），MIAS—4001.5MB～4.5MB,MIAS—1000 2MB～10MB 。灰度等級：256或4096。專用圖像處理器特性：IPU40MHZ主頻，>10MIPS。IFU（圖像浮點處理器）40MHZ主頻，>4MFOPS（每秒兆浮點處理指令）。在各種圖像輸入設備中，以視頻攝像機為圖像的基本輸入設備，也可以配接視頻錄像機、數字掃描儀和連接掃描電鏡的專用接口。高分辯彩色監示器為圖像的基本輸出設備。該系統還具備有自動移位的載物臺和自動聚集控制系統可供用戶選擇。MIAS系列圖像分析儀的軟件系統是在DOS（磁盤操作系統）3.2以上環境開發的，全部采用C語言和匯編語言（80286宏匯編，TMS340系列專用匯編）進行編程，共98個功能模塊。主要功能包括初始化及環境設置、圖像輸入和輸出、圖像編輯、圖像增強、圖像分割、圖像測量、實用程序等。測量參數包括一維和二維目標的各種形態參數，灰度參數和紋理參數等數十種。該系統在長期為華西醫科大學、第一和第四軍醫大學、北京軍事醫學科學院、上海醫科大學、湖南醫學院、哈爾濱醫科大學等數十個醫學單位的服務中，積累了許多有效的實用算法和功能、用戶界面和處理速度方面已達到和超過某些進口中高檔圖像儀的水平。
（二）國外情況
英國的主要生產廠家有劍橋儀器公司（Cambridge Instruments Company），在圖像的測量、計算、比較、分類等功能上都比過去的產品更完善，使用了大功率的新型計算機，使用QUIPS程序可獲得各種圖像分析測量的數據，重現性好。操作者不必精通程序設計語言，只需接受幾小時使用QUIPS語言的教學訓練即可。
英國Ealing—Beck公司生產Histotrak圖像分析系統，如用透射光，該儀器能自動改變放大倍數。具有陰影校正系統。最使研究工作者感興趣的是該儀器中設有坐標發生器，能使被檢圖像的坐標數據通過臺式計算機在輸出打印機上打印出來。
英國Micro Measurements 公司生產電視掃描圖像分析儀，成本較低，用途較多。
英國Joycez—Loebl公司生產Magiscam圖像分析系統，操作較簡單，可解決一般圖像分析問題，并可進行彩色圖像分析，在醫學和放射學等方面適用。
美國的主要廠家有美國美敦設備公司（Milton Roy Company），生產OMNICON圖像分析儀，據上海多國儀器儀表展覽會資料介紹，Ommicon圖像分析系統有Omnicon Alpha500用于常規檢驗和研究。Ommicon FAS—III 用于醫學和生物學領域較合適。Omnicon 3500為一種多用途的系統，配有64K通用NOVA4×計算機。Omnicon 5000是該公司發展的使用起來最方便的定量圖像分析儀。Omnicon 7500是為了對圖像作實時分析而設計的產品。
德國Leitz公司制造Leitz T.A.S圖像分析儀，圖像輸入裝置是一臺Leitz Orthplan顯微鏡，該儀器還包括一臺TU—58雙盒式磁帶機，可用于存貯程序、數據、圖像。該公司產品的新型號是Leitz T.A.S PLUS，增加了自動調焦、自動圖像旋轉等功能。
德國Carl Zeiss公司的產品是Micro—Videomat，主要優點是有適用于計算機和大型計算機的程序。型號有Micro Videomat 2型、3型等。
德國的OPTON公司生產IBAS2000圖像分析系統，可應用于顯微圖像分析的所有領域，如放射自顯影、染色體分析、真色圖像信息、細胞學分析、用連續切片來重建原形、顆粒大小分析、纖維分析、可測定交叉的或重疊的纖維長度及纖維的長/寬比例等。
德國VEB Zeiss Jena公司生產EPIQUANT圖像分析儀，可進行自動或半自動分析。
日本浜板電視公司生產一系列特殊用途的、測量特殊參數的自動分析系統，如其中有一種稱為Multianalyser的，與顯微鏡相結合，可用來測面積、長度等。
對國內外資料收集比較局限，總之購置儀器時要充分了解性能、對價格作比較、才能獲得滿意的結果。
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技術原理
