小鼠辛型肝炎病毒（TTV)酶聯免疫分析（ELISA）
小鼠辛型肝炎病毒（TTV)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用???????目的：本試劑盒用于檢測小鼠血清，血漿及相關液體樣本中辛型肝炎病毒（TTV)水平，感染人的血液學診斷。
實驗原理：
??本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫法（ELISA）測定標本中小鼠辛型肝炎病毒（TTV)。用純化的小鼠辛型肝炎病毒（TTV)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中辛型肝炎病毒（TTV)相結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后再與HRP標記的辛型肝炎病毒（TTV)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中小鼠辛型肝炎病毒（TTV)的存在與否。
試劑盒組成：
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說明書 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | |
密封袋 | 1個 | 1個 | |
酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
陰性對照 | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
陽性對照 | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 3?ml×1瓶 | 6?ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3?ml×1瓶 | 6?ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A液 | 3?ml×1瓶 | 6?ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B液 | 3?ml×1瓶 | 6?ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求：
1.?血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2.?血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3.?尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.?細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.?組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6.?標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7.?不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1.?編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）
2.?加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3.?溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。???
4.?配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
5.?洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6.?加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。?
7.?溫育：操作同3。
8.?洗滌：操作同5。
9.?顯色：每孔先加入顯色劑A?50μl，再加入顯色劑B?50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
10.?終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11.?測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。?測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
結果判定：
??試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00;?陰性對照平均值≤0.10
??臨界值（CUT?OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
??陰性判定：樣品OD值<?臨界值（CUT?OFF）者為辛型肝炎病毒（TTV)陰性
??陽性判定：樣品OD值≥?臨界值（CUT?OFF）者為辛型肝炎病毒（TTV)陽性
注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入
