改進堿性苦味酸法在血清肌酐測定中的應用

【摘要】? 目的：提高血清肌酐測定的準確性。方法：用雙液體試劑中的RI液和標本進行反應，使膽紅素氧化成膽綠素，再進行肌酐的測定，并與原法對比。結果：原法受膽紅素的干擾，雙液體兩步法可有效消除膽紅素的影響。結論：雙液體兩步法消除了膽紅素對肌酐測定的干擾，操作簡單，結果可靠，經濟實用，適合推廣。

【關鍵詞】? 堿性苦味酸法;肌酐;膽紅素

血清肌酐(CREA)測定是臨床中常用的檢測項目，也是急診腎功能檢測項目之一。血清肌酐值是評價腎小球濾過率(GFR)及診斷急性、慢性腎功能衰竭的有效指標。目前，我國臨床實驗室測定血清肌酐的方法主要有兩種：一類是堿性苦味酸法，另一類是酶學測定法。酶法試劑價格昂貴，尚不能達到普及，堿性苦味酸法是目前主要肌酐測定方法[1]。但這種方法的主要缺點是受高膽紅素負干擾而致結果明顯偏低，甚至出現負值。現將雙液體試劑反應步驟進行了改進，把原來的一步法改為兩步法，可有效地消除膽紅素對肌酐測定的負影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑：堿性苦味酸試劑(試劑R1：320 mmol/L氫氧化鈉;試劑R2：35 mmol/L苦味酸，北京中生提供)。肌酐標準液、高、低定值質控血清由英國朗道提供。儀器使用日立7180型全自動生化分析儀。

1.2 方法：①10 μl血清[總膽紅素(TBIL)408 μmol/L]與200 μl試劑R1(320 mmol/L氫氧化鈉)混合后，連續檢測該混合物分別在510 nm和620 nm處吸光度的變化。結果發現48 s以后510 nm吸光度下降緩慢或基本不變，而620 nm處吸光度在32 s后上升緩慢或基本不變。膽紅素被氧化成膽綠素的反應主要發生在標本和RI液混合后50 s以內。②根據上述發現并結合日立7180型全自動生化分析儀的特點，調整反應參數。10 μl血清與100 μl試劑R1(320 mmol/L氫氧化鈉)反應16 s后加入100 μl試劑R2(35 mmol/L苦味酸)，在試劑R2加入后16 s讀取起始吸光度(A1)，再過48 s讀取終末吸光度(A2)，計算時用A2-A1=ΔA。肌酐的含量為:肌酐(μmol/L)=樣品ΔA/標準ΔA×標準濃度(μmol/L)。主波長510 nm，副波長660 nm，反應溫度37 ℃。

2 結果

2.1 兩種檢測方法的比較：選取低值定值質控血清(TBIL 19.2 μmol/L、CREA 93 μmol/L)、高值定值質控血清(TBIL 132 μmol/L,CREA 435 μmol/L)分別用一步法和兩步法在日立7180型全自動生化分析儀各連續測定測定肌酐濃度20次。低值定值質控血清經配對t檢驗，t=0.53,P>0.05,差異無統計學意義;高值定值質控血清配對t檢驗，t=9.49，P<0.05,兩者差異有統計學意義。表1 兩種方法測定肌酐濃度精確性比較

2.2 方法的精確性：本方法低(TBIL 19.2 μmol/L,CREA 93 μmol/L)、高(TBIL 132 μmol/L,CREA 435 μmol/L)兩種質控血清批內變異系數(CV)依次為4.7%、2.94%，批間CV依次為3.79%、2.06%，兩組間比較，說明兩步法精密度良好。詳見表1。

2.3 回收實驗：取3份膽紅素121 μmol/L的血清做試驗，分別加入肌酐濃度為40.4 μmol/L、21.9 μmol/L、11.0 μmol/L，測得回收濃度分別為38.5 μmol/L、21.3 μmol/L、10.8 μmol/L，回收率依次為95.4%、97.2%、99.8%。

3 討論

堿性苦味酸速率法測定的原理是肌酐同堿性苦味酸反應，形成一種紅色復合物，通常在510 nm處根據測定一定時間(20～80 s)內血清和標準液吸光度的增加量計算肌酐的含量。而膽紅素在510 nm處也有較強光吸收，并且在氫氧化鈉的作用下，逐漸轉化為620 nm處有強光吸收的膽綠素，而膽綠素在510 nm處只有很弱的光吸收，這樣就掩蓋了肌酐本身的顯色反應表現，從而使測定結果偏低，甚至出現負值[2]。現將雙液體試劑反應步驟進行了改進，把原來的一步法改為兩步法。這種改進后的方法可以有效地消除膽紅素對肌酐測定的負影響，提高血清肌酐測定的準確性，操作簡單、方便，結果準確，適合臨床推廣。

【參考文獻】

[1] 馬恩龍.堿性苦味酸法和酶法測血清肌酐的方法學比較[J].大連大學學報,2004，12(6)：53.

[2] 葉應嫵.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.南京：東南大學出版社，2006：466