測序技術及DNA序列測定結果分析
實驗概要
?在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 ? Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。
?Sanger ? 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
?Promega公司的SILVER ?SEQUENCETM ?DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。此外, ?SILVER ?SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
?Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對于雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的準確性，能產生均一的條帶，且背景低。
?SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
?退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始于每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對于有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
?由于本系統采用熱循環裝置, ? 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03--2pmol模板DNA, ?隨模板種類而定。(2). ?在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的堿變性及乙醇沉淀過程，變性循環也有助于消除由于線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). ?高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
主要試劑
（1）SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲備液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺 W/V）：95g丙烯酰胺，5g甲叉雙丙烯酰胺溶于140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶于4ml水中，定容至5ml，應新配新用。
（4）10×TBE緩沖液（1 ?mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA）： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 ?EDTA ·2H2O，溶于雙蒸水中定容至1升，置于4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升備用。
（8）染色溶液：硝酸銀2克，甲醛3ml，溶于2升超純水中備用。
（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3）溶于2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml）。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
? ? ? ?（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
實驗步驟
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA模板量, ?每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，并且注意如下幾點：
（1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA一起電泳。
（2）分光光度法對于很多DNA提取物包括質粒小量制備來說，并不能給出一個可信的DNA濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA濃度。
（3） DNA制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳后DNA樣品的前面，并不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。
（一）測序反應：
1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。
2. 對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1）樣品反應：
? ?質粒模板DNA ? 2.1pmol
5×測序緩沖液 ? 5ml
引物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf ?對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) ? ? ?3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。
7. 熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
（二）、測序凝膠板的制備
? 1、玻璃板的處理：
?銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
短玻璃板的處理：
? ?A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。
? ?B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經自然干燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。
? ?C. 4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。
2、凝膠的制備：
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。
凝膠終濃度 | ||||||||
3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 12 | 16 | 18 | |
尿素(g) | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 | 42.0 |
Acr&Bis(ml) | 7.5 | 10.0 | 12.0 | 14.5 | 20.0 | 30.0 | 40.0 | 50.0 |
10×TBE緩沖液(ml) | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 |
雙蒸水(ml) | 47.5 | 45.0 | 43.0 | 40.5 | 35.0 | 25.0 | 15.0 | 5.0 |
10%過硫酸銨(ml) | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.7 | 0.7 |
TEMED(ml) | 87 | 80 | 80 | 80 | 80 | 70 | 47 | 40 |
（3）膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。
（三）電泳：
1、預電泳
? ? （1）當凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
? ? （2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。
? ? （3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源準備預電泳。
? ?? ?（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃后進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
? ? （5）按30V/cm的電壓預電泳20-30分鐘。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
2、樣品的制備：
?當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鐘，立即置于冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4-6%聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小于0.4mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。 ?
3、上樣及電泳
?關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然后立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢后，立即電泳。開始可用30V/cm進行電泳，5分鐘后可提高至40-60V/cm，并保持恒壓狀態。一般來說，一個1375px長，0.2mm厚的凝膠板，在2500V恒壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可采用兩輪或多輪上樣。
（四）、測序凝膠的銀染
?染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
? ? 1. 電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
? ? 2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振蕩20分鐘或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振蕩)。保留固定/停止溶液，用于終止顯影反應。
? ? 3. 洗膠：用超純水振蕩洗膠3次，每次2分鐘。從水中取出, 當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。
? ? 4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鐘。
? ? 5. 凝膠顯影：
? ? ? (1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配制。
? ? ? ? (2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長于5-10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復第五步用染色液浸泡。
? ? ? (3). 立刻將凝膠轉移至1升(總量的一半)預冷的顯影液充分振蕩直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2--3分鐘,或直至所有條帶出現。
? ? 6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應,固定凝膠。
? ? 7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鐘，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
? ? 8. 將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
（五）、EDF膠片顯影
?使用EDF膠片可增強測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數據轉移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉移至EDF膠片之后可增強條帶可讀性。
?1. 在暗室內，將染色過的粘于玻璃板的凝膠(膠面向上)置于熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間, 用一小條EDF膠片曝光不同時間, 檢查不同的曝光強度, 一般曝光20--40秒可得較好結果。
?2. 在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角, 然后把膠片置于凝膠上，使缺口位于左上角。由于EDF膠片是單面的，因此必須確保缺口在左上角。
?3. 在EDF膠片上放置一干凈、干燥的玻璃板，開亮燈箱約20秒。
?4. 用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程:
a. 在Kodak GBX顯影液中顯影1-5分鐘;
b. 水洗1分鐘;
c. 在Kodak GBX定影液中定影3分鐘;
? ? ? d. 水洗1分鐘.?
注意事項
1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 | 模板量 |
200bp (PCR產物) | 16ng(120fmol) |
3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) | 4mg (2pmol) |
48000bp(λ,粘粒DNA) | 1mg(31fmol) |
由于超螺旋質粒產生的信號比松馳的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
???? 4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數
計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對數
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數
3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物，熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
? ? ? 模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50%
? 95℃ 2分鐘。然后： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鐘(延伸)。
? ? ? 模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。
? ? ? ? ? ?95℃ 2分鐘, 然后: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。
4. 在加入終止溶液之后樣品可在4℃保存過夜。
5. 水的質量對于染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質, 則低分子量條帶可能無法出現。
6. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結果。
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技術原理
