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    關于基因轉移轉染細胞的處理方法介紹

    2022.11.09

      ①如果不進行其它處理(如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理,見后),可在細胞培養16~24h后,吸出培養液和沉淀物,用PBS將單層細胞再洗一次。然后按下述③d操作。

      ②在許多情況下,同時用氯喹處理細胞,可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時間不能超越細胞對其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預實驗來決定適于所用特定型別細胞的最佳氯喹濃度。但對于大部分型別的細胞,用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3~5h,都可取得良好效果。可在磷酸鈣-DNA共沉淀物加入細胞之前或之后(見步驟(4)介紹的其它方法),直接將氯喹二磷酸貯存液(過濾除菌并貯于-20℃用金屬泊密封的管中,100mmol/L)稀釋(1:100)于培養液中。在氯喹處理過程中,細胞呈現泡狀是正常的。經用DNA和氯喹處理3~5h后,棄去培養液和沉淀,用PBS洗,然后按下述d操作。

      ③用甘油短暫處理細胞,同樣可提高轉化效率或導入DNA的瞬時表達水平。這一步驟可以在氯喹處理之后進行。由于不同細胞對甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊,因此每種型別的細胞都必須通過預實驗決定最佳處理時間(從30s至3min)。耐受甘油的細胞可以暴露于含磷酸鈣-DNA共沉淀物(含或不含氯喹)的生長液3~5h后進行休克。

      a. 吸出生長液,用PBS將單層細胞洗1次

      b.在單層細胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油,在37℃培養0.5~3min

      c.吸出甘油,用PBS將單層細胞洗1次

      d.加入5ml預加溫的完全生長液,放入培養箱中繼續培養24~60h后,檢測DNA的瞬時表達或將細胞重新種入適當的選擇性培養基中,分離穩定的轉化體。

      ④業以表明,丁酸鈉也可以在猴源和人源細胞中增強帶SV40早期啟動子/增強子的重組質粒的表達。可直接在生長液中加入有關試劑,也可以使經過甘油休克的細胞接受丁酸鈉處理。須視細胞型別的不同,采用不同濃度的丁酸鈉(500mmol/L貯存液,在化學通風櫥中用NaOH中和丁酸制備而成),例如:

      CV-1

      10mmol/L

      NIH-3T3

      7mmol/L

      HelaS3

      5mmol/L

      CHO

      2mmol/L

      不加完全生長液,然后重復步驟d。

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